Multiplex detectie van genexpressie in de intacte Drosophila hersenen met behulp van expansie-ondersteunde iteratieve fluorescentie in situ hybridisatie

We hebben een robuust protocol ontwikkeld waarbij meerdere rondes van in situ hybridisatie kunnen worden uitgevoerd op hetzelfde drosophila-brein, waardoor de expressiepatronen van veel verschillende genen kunnen worden gevisualiseerd. Het inbedden van het vliegenbrein in een hydrogel zorgt voor een uitstekende weefselintegriteit en mRNA-stabiliteit gedurende meerdere hybridisatierondes. Het verbetert ook de optische helderheid bij beeldvorming aanzienlijk.

EASI-FISH kan door elk laboratorium met een confocale of lichtbladmicroscoop worden geadopteerd om genexpressieprofielen van celtypen in het vliegenbrein te definiëren. Veeg om te beginnen een niet-geladen dia af met een RNA-decontaminatiereagens. Verwijder de ondoorzichtige film die de lijm beschermt van de siliconen pakking.

Bevestig vervolgens de pakking met maximaal vier kamers aan de schuif. Gebruik een P20-pipet om elk kameroppervlak te bedekken met één microliter polylysine. Breng vervolgens maximaal vier drosophila-hersenen per buisje over in een PCR-buisje van 0,2 milliliter.

Rehydrateer de hersenen in 150 microliter PBS met 0,1% Triton X-100 gevolgd door PBS. Voeg 40 microliter PBS toe aan elke kamer. Plaats met een fijn pincet de hersenen voorzichtig op een rij in het midden van de kamer, waarbij er wat ruimte tussen blijft.

Verwijder PBS uit de kamer en voeg onmiddellijk 50 microliter 20 millimolaire MEPS-buffer toe. Terwijl de hersenen in evenwicht zijn in de MOPS-buffer, pipetteert u gelijke hoeveelheden ontdooid Melphalan-X in een buisje met MOPS-buffer van hetzelfde volume. Voeg vervolgens Ac-X stockoplossing toe in een verhouding van één op 100.

Draai de oplossing en draai hem kort om hem op te vangen. Verwijder alle MOPS-buffer uit de kamers en voeg 50 microliter van de Melphalan-X Ac-X-oplossing toe. Plaats een dekglaasje op elke kamer zonder de pakkinglijm te gebruiken voor afdichting.

Plaats de kamer vervolgens in een bevochtigde doos. Verwijder de volgende dag voorzichtig het dekglaasje en zuig de Melphalan-X Ac-X-oplossing op. Was de opgezette hersenen twee keer in 100 microliter 0,1% PBT, gevolgd door 100 microliter PBS.

Leg ontdooide oplossingen van TREx-1000 4-Hydroxy-TEMPO, TEMED en ammoniumpersulfaat op ijs. Vortex de TREx-1000-oplossing om ervoor te zorgen dat er geen neerslag valt. Meng de oplossingen om een geloplossing en vortex te bereiden voor het glazuur.

Verwijder met een pipetpunt de PBS uit de kamer en voer eventuele resterende vloeistof af met een pluisvrij doekje. Voeg onmiddellijk 40 microliter geloplossing toe over de hersenen in elke kamer. Incubeer de kamers gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius.

Verwijder nu de geloplossing uit de kamer. Verwijder vervolgens de doorzichtige beschermfilm van de lijm van het pakkingoppervlak. Voeg de laatste 45 microliter verse geloplossing toe.

Plaats voorzichtig een dekglaasje over de kamer en druk op het dekglaasje om de kamer af te sluiten voordat je nog 10 minuten bij vier graden Celsius incubeert. Incubeer de kamer gedurende 1,5 uur bij 37 graden Celsius om de gel te polymeriseren. Nadat u de gels op een bankje hebt afgekoeld, gebruikt u een scheermesje om het dekglaasje en de siliconen pakking voorzichtig te verwijderen.

Snijd de gel in een rechthoekige vorm en snijd de rechterbovenhoek af om de oriëntatie van het monster aan te geven. Gebruik vervolgens een fijn penseel bevochtigd met een kleine hoeveelheid Pro K-buffer om de gels voorzichtig van de dia te tillen. Breng elke gel afzonderlijk over in een microcentrifugebuis van twee milliliter.

Meng 500 microliter Pro K-buffer en vijf microliter proteïnase K-enzym en voeg het mengsel toe aan elke gel. Incubeer 's nachts bij 37 graden Celsius. Verwijder de volgende dag de buffer met een fijne flexibele pipet en was de gels vervolgens drie keer in PBS gedurende elk 10 minuten.

Incubeer de gels gedurende 30 minuten in een milliliter DNASE1-buffer bij 37 graden Celsius. Meng 50 microliter DNASE1-enzym met 450 microliter DNASE1-buffer. Meng voorzichtig zonder vortex.

Incubeer elke gel in 500 microliter DNASE1-oplossing gedurende twee uur bij 37 graden Celsius. Was de gels vervolgens vier keer gedurende 15 minuten met een milliliter PBS op kamertemperatuur. Incubeer nu de gels in 500 microliter ontdooide hybridisatiebuffer zonder sondes gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius.

Verdun de sondes in een hybridisatiebuffer in een verhouding van één op 100 en bereid 300 microliter per gel. Incubeer de gels met hybridisatiebuffer met sondes een nacht bij 37 graden Celsius. Was de gels de volgende dag eerst in de wasbuffer van de sonde en vervolgens in PBS.

Voeg voor de hybridisatiekettingreactie 500 microliter versterkingsbuffer toe aan de gel en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Verwarm de fluorescerende haarspelden gedurende 95 seconden op 90 graden Celsius in een PCR-machine en koel de oplossing gedurende 30 minuten af tot 25 graden Celsius. Verdun voor elke sonde bijpassende haarspeldenparen in een verhouding van één tot 50 in amplificatiebuffer, waarbij u 300 microliter per gel bereidt.

Voeg na het vortexen van het mengsel het mengsel toe aan de gels en incubeer. Om de gel voor light sheet imaging te monteren, smeer je het gelbevestigingsoppervlak van een gelhouder twee keer in met één microliter polylysine en laat je het tussen de lagen drogen bij 37 graden Celsius. Plaats vervolgens de gel op een dekglaasje zodat de snede aan de linkerkant zit.

Breng de gel met een penseel in één beweging over op het behandelde oppervlak. Neurotransmitter-geassocieerde genen en neuropeptidegenen vertoonden verschillende expressiepatronen in de volwassen drosophila-hersenen. VGluT en Gad1 werden samen gedetecteerd in dezelfde hybridisatieronde, waarbij niet-overlappende expressiepatronen werden vertoond.

AstA vertoonde een sterke expressie in de optische lob en een zwakkere expressie in het centrale complex. Crz kwam sterk tot expressie in de pars lateralis, terwijl lagere expressieniveaus werden waargenomen in neuronen van de optische kwab. Tk werd gedetecteerd in H-delta D-neuronen geïdentificeerd met Mer-GFP-expressie met behulp van een specifieke gesplitste GAL4-lijn door middel van lichte plaat of confocale microscopie.

FMRFamide was afwezig in PFG-neuronen gemarkeerd door Mer-GFP, maar gedetecteerd in omliggende neuronen. Beeldvorming met hoge resolutie van FB4K-neuronen bevestigde de ruimtelijke verdeling van VGluT- en ChAT/VAChT-transcripten. Neuropeptiden, zoals AstA en Crz, komen in sommige cellen zo sterk tot expressie dat individuele fluorescerende vlekken die afzonderlijke transcripten vertegenwoordigen, niet langer kunnen worden gescheiden.