Name: Multiplex detectie van genexpressie in de intacte Drosophila hersenen met behulp van expansie-ondersteunde iteratieve fluorescentie in situ hybridisatie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-02T13:05:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: Leer EASI-FISH voor multiplex genexpressie-analyse in intacte Drosophila-hersenen. Deze methode combineert expansiemicroscopie met fluorescentie in situ hybridisatie om expressiepatronen van meerdere genen in dik weefsel te visualiseren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We bedanken Paul Tillberg voor advies over de dynamiek van expansiemicroscopie, Christina Christoforou voor hulp bij hersendissecties en Geoffrey Meissner voor kritisch feedback. We danken ook Tanya Wolff en Gerry Rubin, evenals Geoffrey Meissner en Wyatt Korff, voor het toestaan om resultaten op te nemen die werden gegenereerd als onderdeel van twee grotere studies. Al het werk werd uitgevoerd op de Janelia Research Campus en ondersteund door het Howard Hughes Medical Institute via fondsen aan de MultiFISH en Fly-eFISH Project Teams, Gerry Rubin en Project Technical Resources.

Dit protocol werd uitgevoerd op volwassen (5-6 dagen oude) Drosophila melanogaster vrouwtjes, maar elk geslacht of Drosophila soort is toepasbaar. Voor recepten voor gel-ankers, zie Aanvullende Tabel 1; voor het gelrecept, Aanvullende Tabel 2; en voor andere EASI-FISH reagentia, Aanvullende Tabel 3. Voor een dagelijkse handleiding voor materialen en reagentia, zie Aanvullende Tabel 4. Voor de gelhouder voor de lichtbladmicroscoop, zie Aanvullend Bestand 1.Figuur 1A-C toont een schematische weergave van de inbedding van hersenen in gels vóór expansie en sondehybridisatie (stappen 2.1 tot 3.8). Figuur 1D is een foto van de ingebedde hersenen, Figuur 1E toont een gelhouder voor lichtbladmicroscopie, en Figuur 1F geeft de tijdlijn van een typisch experiment weer. De commerciële details van de gebruikte reagentia en apparatuur staan in de Tabelle van Materialen.
1. Dissectie en fixatie van vlieg-hersenen
<ol>
	<li>Dissecteer vlieg-hersenen of het centrale zenuwstelsel in koud S2 medium (voor meer details over dissectie, zie referentie21)</li>
	<li>Voeg tot 20 hersenen of 10 centraal zenuwstelsels toe aan 2 mL koud 4% PFA/PBS en incubeer een nacht op een nutator bij 4°C om de hersenen te fixeren. 
	VOORSICHT: PFA is schadelijk als het wordt ingeslikt of ingeademd, irriterend voor huid en ogen, en kan kankerverwekkend zijn.</li>
	<li>Spoel de monster (1x) met 2 mL koud PBT (0.5%, zie Aanvullende Tabel 4), spoel het monster vervolgens met 2 mL koud PBT (4x) gedurende 15 min op een nutator bij 4 °C.</li>
	<li>Spoel de monster (1x) met 2 mL koud 70% EtOH. Bewaar de hersenen in 2 mL 70% EtOH bij 4 °C gedurende maximaal 6 maanden.</li>
</ol>
2. Hersenen monteren en RNA- en proteïnelinkers toevoegen (Dag 1)
OPMERKING: Draag altijd handschoenen en veeg het materiaal en het werkgebied consequent af met RNase Away. Handschoenen zijn vereist (1) om RNases weg te houden van monsters en (2) ter bescherming tegen verschillende reagentia die een gezondheidsrisico vormen.
<ol>
	<li>Bereid gelkamers voor door een niet-geladen glasplaatje af te vegen met een RNase-decontaminatiemiddel. Verwijder de ondoorzichtige film die de lijm beschermt tegen de siliconen ring, hecht de ring (met maximaal 4 kamers) aan de glasplaat en bedek elk kameroppervlak met 1 μL poly-lysine met behulp van een P20 pipettepunt. Laat het drogen en herhaal het proces. 
	OPMERKING: Stap 2.1 kan de dag ervoor worden gedaan.</li>
	<li>Breng de hersenen over naar een 0.2 mL PCR buisje (maximaal 4 hersenen per buisje) en rehydreer gedurende (2x) 5 min in 150 μL PBT (0.1%) en (2x) gedurende 5 min in PBS.</li>
	<li>Om de hersenen te monteren, voeg 40 μL PBS per kamer toe, stak vervolgens voorzichtig de hersenen in een rij in het midden van de kamer met fijne pincetten, waarbij u enige ruimte tussen de hersenen laat (zie Figuur 1D). Het is mogelijk om maximaal 6 hersenen of 2 centraal zenuwstelsels per kamer te monteren.</li>
	<li>Verwijder PBS en voeg onmiddellijk 50 μL van 20 mM MOPS buffer toe. Incubereer gedurende 30 min bij kamertemperatuur (RT).</li>
	<li>Terwijl de hersenen in MOPS buffer zijn geëquilibreerd, ontdooi de Melphalan-X en Ac-X stamoplossingen en bereid 75 μL van Melphalan-X/Ac-X oplossing per kamer (verdun Melphalan-X stam 1:1 met MOPS buffer en voeg Ac-X toe bij 1:100). Vorm en draai kortjes om de oplossing te verzamelen; tijd de bereiding zo dat de oplossing klaar is aan het einde van de 30 min incubatietijd, niet eerder. 
	VOORSICHT: Melphalan-X is schadelijk als het wordt ingeslikt of ingeademd, irriterend voor huid en ogen, en kan kankerverwekkend zijn.</li>
	<li>Verwijder alle MOPS buffer en voeg 50 μL van Melphalan-X/Ac-X oplossing toe.</li>
	<li>Dek de kamer af door een dekglas bovenop te plaatsen, maar gebruik de lijm van de ring niet om af te sluiten. Plaats de kamer in een bevochtigde doos en incubeer beschermd tegen licht een nacht bij RT.</li>
</ol>
3. Gelatie en Proteinase K-digestie (Dag 2)
<ol>
	<li>Verwijder voorzichtig het dekglas en Melphalan-X/Ac-X en spoel de gemonteerde hersenen (2x) gedurende 2 min met 100 μL PBT (0.1%) en (1x) gedurende 2 min met 100 μL PBS.</li>
	<li>Ontdooi TREx-1000 oplossing, 4HT, TEMED en APS en houd op ijs. 
	OPMERKING: TREx-1000 kan uitkristalliseren bij -20 °C; draai goed om om volledig op te lossen na het ontdooien. 
	VOORSICHT: Deze reagentia zijn schadelijk of giftig wanneer ze worden ingeslikt of ingeademd, evenals irriterend voor huid en ogen.</li>
	<li>Bereid de geloplossing voor door TREx-1000 te mengen met 4HT, TEMED en APS in een verhouding van 94:2:2:2. Vorm en houd op ijs. Bereid voor elke kamer 150 μL geloplossing.</li>
	<li>Verwijder PBS uit de kamer met een pipette

<ol><li>Langer-Safer, P. R., Levine, M., Ward, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+method+for+mapping+genes+on+phila+polytene+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Immunological method for mapping genes on phila polytene chromosomes.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 79 (14), 4381-4385 (1982).</li>
<li>Gall, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+of+in+situ+hybridization+-+A+personal+history%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">The origin of in situ hybridization - A personal history.</a> Methods. 98, 4-9 (2016).</li>
<li>Kwon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+fluorescence+in+situ+hybridization%3A+Quantitative+imaging+of+single+RNA+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22BMB+Rep%22%5BJournal%5D)">Single-molecule fluorescence in situ hybridization: Quantitative imaging of single RNA molecules.</a> BMB Rep. 46 (2), 65-72 (2013).</li>
<li>Long, X., Colonell, J., Wong, A. M., Singer, R. H., Lionnet, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+mRNA+imaging+throughout+the+entire+Drosophila+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative mRNA imaging throughout the entire Drosophila brain.</a> Nat Methods. 14 (7), 703-706 (2017).</li>
<li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+fluorescence+in+situ+hybridization+for+quantitating+post-transcriptional+regulation+in+Drosophila+brains%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Single-molecule fluorescence in situ hybridization for quantitating post-transcriptional regulation in Drosophila brains.</a> Methods. 126, 166-176 (2017).</li>
<li>Meissner, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+neurotransmitter+identity+in+the+whole-mount+Drosophila+brain+using+multiplex+high-throughput+fluorescence+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Mapping neurotransmitter identity in the whole-mount Drosophila brain using multiplex high-throughput fluorescence in situ hybridization.</a> Genetics. 211 (2), 473-482 (2019).</li>
<li>Duckhorn, C. J., Junker, I. P., Ding, Y., Shirangi, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+in+situ+hybridization+chain+reaction+and+immunostaining+to+visualize+gene+expression+in+whole-mount+Drosophila+central+nervous+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioral+Neurogenetics%22%5BJournal%5D)">Combined in situ hybridization chain reaction and immunostaining to visualize gene expression in whole-mount Drosophila central nervous systems.</a> Behavioral Neurogenetics. 181, 1-14 (2022).</li>
<li>Eng, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome-scale+super-resolved+imaging+in+tissues+by+RNA+seqFISH%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transcriptome-scale super-resolved imaging in tissues by RNA seqFISH.</a> Nature. 568 (7751), 235-239 (2019).</li>
<li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+resolved+cell+atlas+of+the+mouse+primary+motor+cortex+by+MERFISH%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Spatially resolved cell atlas of the mouse primary motor cortex by MERFISH.</a> Nature. 598 (7879), 137-143 (2021).</li>
<li>Janssens, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+transcriptomics+in+adult+Drosophila+reveals+new+cell+types+in+the+brain+and+identifies+subcellular+mRNA+patterns+in+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Spatial transcriptomics in adult Drosophila reveals new cell types in the brain and identifies subcellular mRNA patterns in muscles.</a> eLife. 13, RP92618(2024).</li>
<li>Gandin, V., et al. Deep-tissue spatial omics: Imaging whole-embryo transcriptomics and subcellular structures at high spatial resolution. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGandin%2C+V+%22bioRxiv%22">bioRxiv</a>. , (2024).</li>
<li>Fang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+single-cell+transcriptome+imaging+of+thick+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional single-cell transcriptome imaging of thick tissues.</a> eLife. 12, RP90029(2023).</li>
<li>Moses, L., Pachter, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Museum+of+spatial+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Museum of spatial transcriptomics.</a> Nat Methods. 19 (5), 534-546 (2022).</li>
<li>Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging%3A+Expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical imaging: Expansion microscopy.</a> Science. 347 (6221), 543-548 (2015).</li>
<li>Chen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+imaging+of+RNA+with+expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Nanoscale imaging of RNA with expansion microscopy.</a> Nat Methods. 13 (8), 679-684 (2016).</li>
<li>Schwarzkopf, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybridization+chain+reaction+enables+a+unified+approach+to+multiplexed%2C+quantitative%2C+high-resolution+immunohistochemistry+and+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Hybridization chain reaction enables a unified approach to multiplexed, quantitative, high-resolution immunohistochemistry and in situ hybridization.</a> Development. 148 (22), 199847(2021).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EASI-FISH+for+thick+tissue+defines+lateral+hypothalamus+spatio-molecular+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">EASI-FISH for thick tissue defines lateral hypothalamus spatio-molecular organization.</a> Cell. 184, 6361-6377 (2021).</li>
<li>Eddison, M., Ihrke, G. Expansion-assisted iterative fluorescence in situ hybridization (EASI-FISH) in Drosophila CNS. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEddison%2C+M+%22protocols.io%22">protocols.io</a>. , (2022).</li>
<li>Meissner, G., et al. A split-GAL4 driver line resource for Drosophila CNS cell types. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMeissner%2C+G+%22bioRxiv%22">bioRxiv</a>. , (2024).</li>
<li>Nern, A., et al. Connectome-driven neural inventory of a complete visual system. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNern%2C+A+%22bioRxiv%22">bioRxiv</a>. , (2024).</li>
<li>FlyLight Protocol. , HHMI Janelia Research Campus. Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.janelia.org/project-team/flylight/protocols">https://www.janelia.org/project-team/flylight/protocols</a> (2025).</li>
<li>HCR Amplification Technology. , HCR. Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.molecularinstruments.com/technology">https://www.molecularinstruments.com/technology</a> (2025).</li>
<li>Wolff, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-type-specific+driver+lines+targeting+the+Drosophila+central+complex+and+their+use+to+investigate+neuropeptide+expression+and+sleep+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Cell-type-specific driver lines targeting the Drosophila central complex and their use to investigate neuropeptide expression and sleep regulation.</a> eLife. 14, RP104764(2025).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Watanabe, K., Chiu, H., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-brain+in+situ+mapping+of+neuronal+activation+in+Drosophila+during+social+behaviors+and+optogenetic+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Whole-brain in situ mapping of neuronal activation in Drosophila during social behaviors and optogenetic stimulation.</a> eLife. 12, RP92380(2024).</li>
<li>Damstra, H. G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+cellular+and+tissue+ultrastructure+using+Ten-fold+Robust+Expansion+Microscopy+%28TREx%29%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Visualizing cellular and tissue ultrastructure using Ten-fold Robust Expansion Microscopy (TREx).</a> eLife. 11, e73775(2022).</li>
<li>Xu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+state+coding+by+molecularly+defined+paraventricular+hypothalamic+cell+type+ensembles%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Behavioral state coding by molecularly defined paraventricular hypothalamic cell type ensembles.</a> Science. 370 (6514), abb2494(2020).</li>
<li>Wang, Y., et al. EASI-FISH for thick tissue defines lateral hypothalamus spatio-molecular organization. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWang%2C+Y+%22GitHub%22">GitHub</a>. , (2021).</li>
<li>Park, G., et al. Using Amira to generate cell body masks in fluorescent light sheet microscopy images of EASI-FISH samples. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPark%2C+G+%22protocols.io%22">protocols.io</a>. , (2023).</li>
<li>Bahry, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RS-FISH%3A+Precise%2C+interactive%2C+fast%2C+and+scalable+FISH+spot+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">RS-FISH: Precise, interactive, fast, and scalable FISH spot detection.</a> Nat Methods. 19 (12), 1563-1567 (2022).</li>
<li>Managan, C., Ihrke, G. EASI-FISH spot counting in Drosophila brain using RS-FISH. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aManagan%2C+C+%22protocols.io%22">protocols.io</a>. , (2024).</li>
</ol>

Er werd geen belangenconflict gedeclareerd.

Het beschreven EASI-FISH-protocol voor het intacte Drosophila zenuwstelsel maakt de detectie van tientallen transcripten in dezelfde hersenen of CNS mogelijk. Het is robuust, eenvoudig en gevoelig, en het kan worden gecombineerd met GFP-detectie om subsets van neuronen of gliacellen te identificeren. Omdat deze methode gemakkelijk te implementeren is, zou het onderzoek moeten vergemakkelijken door Drosophila labs met interesse in het in kaart brengen en kwantificeren van genexpressie in de intacte vlieg...

FISH werd voor het eerst meer dan 40 jaar geleden gebruikt in Drosophila om genen op polyteende chromosomen in kaart te brengen1,2. Tegenwoordig is FISH op enkele moleculen de gouden standaard voor het ruimtelijk lokaliseren en kwantificeren van mRNA-transcripten in intact weefsel3. Echter, vanwege problemen met de integriteit van het monster en RNA-verlies, zijn FISH-technieken met enkele moleculen op hele monsters in Drosophila beperkt tot slechts een paar genen die in hetzelfde monster kunnen worden geanalyseerd4,5,6,7. Hoewel de recente ontwikkeling van barcodering (bijv.8,9,10) het aantal transcripten dat kan worden gedetecteerd tot enkele honderden verhoogt, zelfs in dik weefsel11,12, vereist de totstandkoming van dergelijke protocollen een aanzienlijke investering van middelen, wat een belemmering voor implementatie kan zijn. Inderdaad, veel inventieve ruimtelijke transcriptomische technieken hebben zich nooit verspreid buiten hun instellingen van oorsprong13. Daarom zou een eenvoudige en relatief goedkope methode om de expressie van tientallen genen in dezelfde intacte hersenen te detecteren, verschillende onderzoeksdoelstellingen vergemakkelijken: validatie van RNA-seq en cell atlas gegevens, het in kaart brengen van moleculaire celtypen over het CZS, het kwantificeren van ontwikkelings-, geslachts- of soortspecifieke verschillen in genexpressie, of het meten van veranderingen in genexpressie geïnduceerd door de grote verscheidenheid aan genetische of omgevingsverstoringen die beschikbaar zijn in Drosophila.
Expansie microscopie is een techniek die onderzoekers in staat stelt weefsels met een hogere resolutie te observeren door ze uit te breiden in een opzwellend hydrogel14. EASI-FISH combineert expansie microscopie en RNA FISH15, die de hybridisatiekettingreactie (HCR) gebruikt, een niet-enzymatische techniek om oligo sonde binding te detecteren16. EASI-FISH werd voor het eerst ontwikkeld als een alternatieve aanpak voor FISH op dun weefsel om expressiepatronen van tientallen genen in dikke (300 µm) weefselsneden van de laterale hypothalamus van muizen in kaart te brengen17. Deze methode is ideaal voor toepassing op volwassen vlieg hersenen, aangezien dit weefsel minder dan 300 µm dik is, en een prototype vlieg EASI-FISH-protocol is onlangs beschreven18. Hier worden gedissekteerde en gefixeerde Drosophila hersenen ingebed in een opzwellend hydrogel, waar mRNA en eiwitten covalent worden verankerd aan het gelpolymeer met de alkyleringsmiddelen Melphalan-X en Acryloyl-X (Ac-X), respectievelijk. Na eiwitdigestie, die isotrope expansie van de hersenen mogelijk maakt, worden genspecifieke DNA oligo proben gehybridiseerd aan mRNA in het weefsel om transcripten van belang te lokaliseren. Fluorescent gelabelde DNA haarspeldjes worden vervolgens toegevoegd in een tweede hybridisatie stap. Meerdere haarspeldmoleculen polymeriseren in de HCR reactie om metastabiele DNA polymeren te vormen. Dit leidt tot een versterking van het signaal voor individuele transcripten, die kunnen worden gedetecteerd als heldere vlekken door lichtblad of confocale microscopie.
Het covalente verankeren van mRNA en eiwit aan de gelmatrix en proteolytische vertering van eiwitten na gelvorming creëert een omgeving waar mRNA transcripten relatief stabiel zijn en mogelijk toegankelijker zijn voor sonde binding. De stabiliteit van mRNA en de gel maakt meerdere rondes van heronderzoek en beeldvorming mogelijk, met het strippen van DNA sondes en HCR product door incubatie met het enzym DNase1 tussen rondes15,17. Bovendien vermindert expansie van het monster de autofluorescentie en lichtverstrooiing door moleculaire ontkromming en verhoogt effectief de beeldresolutie14. Daarom kunnen individuele mRNA transcripten gemakkelijker worden opgelost.
GFP ondersteunt de procedure voldoende om detecteerbaar te blijven door fluorescentie of post-expansie antilichaam binding. Daarom kan deze reporter worden gebruikt om celtypen van belang te markeren en te segmenteren. In combinatie met de vele neuron-specifieke split-GAL4 driver lijnen die beschikbaar zijn (bijv.19,20), opent dit de mogelijkheid om verdere inzicht te krijgen in de moleculaire identiteit van een neuronaal type of om moleculaire subtypes te identificeren die niet gemakkelijk te onderscheiden zijn door hun anatomie.
Hier wordt een bijgewerkte versie van het prototype vlieg EASI-FISH-protocol18 beschreven met uitstekende mRNA retentie, verwijdering van technische moeilijkheden en grotere robuustheid van de gel. Aanpassingen omvatten het verhogen van de PFA-concentratie, het verlagen van de temperatuur van fixatie en het vergemakkelijken van de monstervoorbereiding door de hersenen te monteren vóór incubatie met Melphalan-X en Ac-X. Dit protocol bevat ook een nieuw gelrecept om de robuustheid van het gel te verhogen, wat effectief gelschade vermindert bij het uitvoeren van veel rondes van FISH en beeldvorming. Deze aanpassingen maken het protocol eenvoudiger uit te voeren, verminderen zowel de verwerkingstijd als het gebruik van reagentia en verhogen de vertrouwen in consistente resultaten. Belangrijk is dat de mogelijkheid van multiplexing is verhoogd zodat tientallen genen in dezelfde hersenen kunnen worden onderzocht over een periode van maanden. Dit wordt geïllustreerd door de expressiepatronen van verschillende neuronale genen in de volwassen Drosophila hersenen over een reeks expressieniveaus.</p

<table><tbody><tr><td>0.2 mL PCR tubes&nbsp;</td><td>USA Scientific&nbsp;</td><td>1402-4700</td><td></td></tr><tr><td>0.5 mL screw-cap microcentrifuge tubes, Amber</td><td>USA Scientific&nbsp;</td><td>1405-9707</td><td></td></tr><tr><td>0.5M EDTA, PH 8, RNase free</td><td>Invitrogen</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>10M NaOH</td><td>Sigma</td><td>72068</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>BP 3994</td><td></td></tr><tr><td>20x SSC</td><td>ThermoFisher</td><td>AM 9763</td><td></td></tr><tr><td>40% Acrylamide&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1610140</td><td></td></tr><tr><td>4-Hydroxy-TEMPO (4HT)</td><td>Sigma</td><td>176141</td><td></td></tr><tr><td>5 M NaCl RNase-free&nbsp;</td><td>Thermofisher</td><td>AM97060G</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Transfer Pipet- Fine tip</td><td>Global Scientific&nbsp;</td><td>134070-S20</td><td></td></tr><tr><td>6 Well Glass Bottom Plate&nbsp;</td><td>Cellvis</td><td>P06-1.5H-N</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile, anhydrous&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>042311-K7</td><td></td></tr><tr><td>Acrylic Acid</td><td>TCI</td><td>A0141</td><td></td></tr><tr><td>Acryloyl-X&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>A20770</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium persulphate (APS)</td><td>Sigma</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>Amplification Buffer&nbsp;</td><td>Molecular Instruments</td><td>https://store.molecularinstruments.com/new-bundle/rna-fish</td><td></td></tr><tr><td>Anhydrous DMSO</td><td>Invitrogen</td><td>D12345</td><td></td></tr><tr><td>AstA_B2</td><td>Molecular Instruments</td><td>PRR477</td><td></td></tr><tr><td>ChAT_B1</td><td>Molecular Instruments</td><td>PRG115</td><td></td></tr><tr><td>Crz_B5</td><td>Molecular Instruments</td><td>PRR480</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>FIJI</td><td>Open source</td><td>https://imagej.net/software/fiji/</td><td></td></tr><tr><td>FMRFa_B2</td><td>Molecular Instruments</td><td>PRR487</td><td></td></tr><tr><td>GAD1_B5</td><td>Molecular Instruments</td><td>RTE581</td><td></td></tr><tr><td>GFP Polyclonal Antibody, Alexa Fluor 488</td><td>ThermoFisher</td><td>A-21311</td><td></td></tr><tr><td>Hybridization Buffer</td><td>Molecular Instruments</td><td>https://store.molecularinstruments.com/new-bundle/rna-fish</td><td></td></tr><tr><td>Imaris Stitcher</td><td>Oxford Instruments</td><td>https://imaris.oxinst.com/products/imaris-stitcher</td><td></td></tr><tr><td>Imaris viewer</td><td>Oxford Instruments</td><td>https://imaris.oxinst.com/imaris-viewer</td><td></td></tr><tr><td>JF-669, SE&nbsp;</td><td>Tocris</td><td>6420</td><td></td></tr><tr><td>Melphalan</td><td>Caymen Chemicals</td><td>16665</td><td></td></tr><tr><td>MOPs Buffer</td><td>Fisher</td><td>BP308-100</td><td></td></tr><tr><td>N,N Methylene-Bis-acrylamide&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1610142</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N&rsquo;,N&rsquo;-Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td><td>Sigma</td><td>T22500</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease Free Water&nbsp;</td><td>Ambion</td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr><td>Oligo Probes&nbsp;</td><td>Molecular Instruments</td><td>https://store.molecularinstruments.com/new-bundle/rna-fish</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>EMS</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher&nbsp;</td><td>BP24384</td><td></td></tr><tr><td>Photoflo-200&nbsp;</td><td>EMS</td><td>74257</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-lysine hydrobromide (polylysine)</td><td>Sigma</td><td>P1524</td><td></td></tr><tr><td>Probe Wash Buffer</td><td>Molecular Instruments</td><td>https://store.molecularinstruments.com/new-bundle/rna-fish</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K&nbsp;</td><td>NEB</td><td>P8107S</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Nucleotide Removal Kit</td><td>Qiagen</td><td>28306</td><td></td></tr><tr><td>RNase Away&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>7003, decontamination reagent</td><td></td></tr><tr><td>RNase-Free DNase1</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>S2 Medium</td><td>ThermoFisher</td><td>21720024</td><td></td></tr><tr><td>Silicone Gaskets&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>P24743</td><td></td></tr><tr><td>Tdc2_B5</td><td>Molecular Instruments</td><td>RTE880</td><td></td></tr><tr><td>Tk_B5</td><td>Molecular Instruments</td><td>PRR484</td><td></td></tr><tr><td>UltaPure 10% SDS</td><td>Thermofisher</td><td>15553027</td><td></td></tr><tr><td>Ultrapure BSA</td><td>ThermoFisher</td><td>AM2616</td><td></td></tr><tr><td>Unconjugated and Alexa Fluor-conjugated Hairpins</td><td>Molecular Instruments</td><td>https://store.molecularinstruments.com/new-bundle/rna-fish</td><td></td></tr><tr><td>VAChT_B1</td><td>Molecular Instruments</td><td>RTA904</td><td></td></tr><tr><td>vGLUT_B2</td><td>Molecular Instruments</td><td>RTB212</td><td></td></tr><tr><td>Zeis Z7 Gel Holder&nbsp;</td><td>Janelia&nbsp;</td><td>CAD files avaiable on request</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM 980 confocal Inverted microscope</td><td>Zeiss</td><td>https://www.janelia.org/node/46947/#lsm980</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Z7 light sheet microscope</td><td>Zeiss</td><td>https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/light-microscopes/light-sheet-microscopes/lightsheet-7.html</td><td></td></tr></tbody></table>

multiplex detectie van genexpressie in de intacte drosophila hersenen met behulp van expansie-ondersteunde iteratieve fluorescentie in situ hybridisatie

Multiplex Detection of Gene Expression in the Intact Drosophila Brain Using Expansion-Assisted Iterative Fluorescence In Situ Hybridization

Het begrijpen van genexpressie is essentieel voor het ontcijferen van cellulaire functies. Echter, methoden voor het analyseren van de expressie van talloze genen in situ binnen een bepaald weefsel blijven beperkt. Het EASI-FISH protocol dat hier wordt beschreven, is aangepast om de expressie van tientallen genen in het intacte centrale zenuwstelsel (CZS) van volwassen Drosophila te detecteren met behulp van commercieel verkrijgbare reagentia. Dit protocol omvat een nieuwe gelformulering die de robuustheid van de gel verbetert, waardoor meerdere rondes van hybridisatie mogelijk zijn en meerdere hersenen per gel kunnen worden ingebed. Deze verbetering verhoogt de doorvoer, vergemakkelijkt optimale vergelijking van experimentele omstandigheden en verlaagt de reagentiakosten. Bovendien, door het gebruik van het GAL4-UAS systeem voor co-detectie van groen fluorescent proteïne (GFP), kan genexpressie worden gevisualiseerd in specifieke neuronale of gliale celtypen. Opmerkelijk is dat de hoge resolutie die wordt bereikt door expansiemicroscopie, in combinatie met de gevoeligheid van de methode, de detectie van enkele RNA-transcripten mogelijk maakt. Deze aanpak integreert effectief hoge beeldkwaliteit met hoge doorvoer, waardoor het een krachtig hulpmiddel wordt voor het bestuderen van genexpressie in de gehele intacte vliegenhersenen.

De prestaties van dit aangepaste EASI-FISH-protocol worden aangetoond door de expressie van verschillende neurotransmitter-geassocieerde en neuropeptide-genen in het volwassen Drosophila-brein over meerdere ronden te detecteren. Gewoonlijk werden gegelde en uitgebreide breinen gehybridiseerd met twee of drie probes per ronde, gevolgd door HCR met hairpin-paren geconjugeerd met Alexa Fluor (AF) 488 (tenzij GFP tot expressie kwam), AF546 en AF647 of Janelia Fluor (JF) 669. De beeldvorming werd grotendeels uitgevoe...

Expansie-ondersteunde iteratieve fluorescentie in situ hybridisatie (EASI-FISH) is een robuuste techniek die expansiemicroscopie combineert met fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) om de expressie van meerdere genen in dik weefsel te detecteren. Dit protocol schetst recente vorderingen in de methode en de aanpassing ervan voor het labelen van het intacte Drosophila centrale zenuwstelsel..

Multiplex detectie van genexpressie in de intacte Drosophila hersenen met behulp van expansie-ondersteunde iteratieve fluorescentie in situ hybridisatie

Understanding gene expression is essential for deciphering cellular functions. However, methods for analyzing the expression of numerous genes in situ ...

multiplex-detection-gene-expression-intact-drosophila-brain-using

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Dubbele Fluorescentie In situ Hybridisatie in Fresh Brain secties

This video demonstrates the immunofluorescence staining of a transgenic Drosophila brain for single-cell imaging of glial cells. The brain expresses membrane-targeted proteins fused with different combinations of antigenic epitopes under the control of a glial-specific recombinase system. The isolated and fixed brains are stained with primary antibodies specific to the antigenic epitopes, followed by fluorophore-conjugated secondary antibodies. This labeling enables the simultaneous imaging of...

Immunofluorescence Staining of Drosophila Brains for the Single-Cell Imaging of Glial Cells

Source: Jolly, S., et.al. Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections. J. Vis. Exp. (2016).This video demonstrates the use of double fluorescence in situ hybridization to visualize the expression of two RNA targets in mouse brain sections. The protocol involves sequential detection of RNA using probes labeled with fluorescein isothiocyanate and digoxigenin, followed by enzymatic signal...

 Performing Double Fluorescence In Situ Hybridization to Detect Gene Expression in Mouse Brain Sections

Hier beschrijven we een geheel gemonteerde...

Hele Mount RNA TL<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie van<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryo&#39;s

We beschrijven een multi-target chromogene whole-mount in situ hybridisatie (MC-WISH) procedure in intacte Drosophila embryo's toestaan ​​gelijktijdige en specifieke detectie van drie verschillende mRNA distributie patronen door contrasterende kleur neerslagen.

Multi-target Chromogene Whole-mount<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie voor het vergelijken van genexpressie Domeinen in<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryo

Het lokaliseren van genexpressie naar specifieke celtypen kan een uitdaging zijn vanwege het ontbreken van specifieke antilichamen. Hier beschrijven we een protocol voor gelijktijdige driedubbele detectie van genexpressie door dubbele fluorescentie RNA in situ hybridisatie te combineren met immunokleuring.

De combinatie van Double Fluorescentie<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie met immunolabel voor detectie van de expressie van drie genen in de hersenen van muizen Secties

Cellen weergeven van verschillende morphologies en stellen een verscheidenheid van interacties met hun buren. Dit protocol wordt beschreven hoe te onthullen van de morfologie van afzonderlijke cellen en cel-cel interactie onderzoeken met behulp van de gevestigde Gal4/UAS expressie systeem.

Toepassing van MultiColor FlpOut techniek om hoge resolutie eencellige Morphologies en cel interacties van Glia in Drosophila te studeren

Het beschreven RNA in situ hybridisatie protocol staat toe de opsporing van RNA in hele Drosophila embryo's of ontleed weefsels. Met behulp van 96-wells microtiterplaat platen en tyramide signaal versterking, kunnen afschriften worden gedetecteerd op hoge resolutie, gevoeligheid en doorvoer, en tegen een relatief lage prijs.

Hoge resolutie fluorescentie In Situ hybridisatie in Drosophila embryo's en weefsels met behulp van Tyramide signaal versterking

Dit protocol beschrijft de stappen die nodig zijn om hybridisatiekettingreactie fluorescerende in situ hybridisatie (HCR-FISH) uit te voeren in oogtische lobben van Drosophila melanogaster-larven . Procedures voor probe-ontwerp, hybridisatie, amplificatie en weefselmontage worden gedetailleerd om de visualisatie van de zich ontwikkelende optische kwab te vergemakkelijken.

Hybridisatiekettingreactie FISH in de zich ontwikkelende Drosophila optische lob

Een demonstratie van de fabricage en het gebruik van een extracellulair zuigkracht elektrode gebruikt om de elektrofysiologische opnamen van neonatale knaagdieren ruggenmerg te...

Spinal Cord Elektrofysiologie II: Extracellulaire Suction Elektrode Fabrication

Leer EASI-FISH voor multiplex genexpressie-analyse in intacte Drosophila-hersenen. Deze methode combineert expansiemicroscopie met fluorescentie in situ hybridisatie om expressiepatronen van meerdere genen in dik weefsel te visualiseren.

Multiplex detectie van genexpressie in de intacte Drosophila hersenen met behulp van expansie-ondersteunde iteratieve fluorescentie in situ hybridisatie (Video) | JoVE Journal

Multiplex detectie van genexpressie in de intacte Drosophila hersenen met behulp van expansie-ondersteunde iteratieve fluorescentie in situ hybridisatie

Meer video's verkennen