Plasmidestabiliteitsanalyse met open-source druppelmicrofluïdica
27 december 2024
Een toegankelijke, open-source microfluïdische workflow wordt gepresenteerd voor de geparallelliseerde analyse van plasmideretentie in bacteriën. Door fluorescentiemicroscopie toe te passen om de aanwezigheid van plasmide in eencellige microkolonies in gelmicrodruppels te kwantificeren, biedt deze methode een nauwkeurig, toegankelijk en schaalbaar alternatief voor traditionele plaattelling.
We ontwikkelen high-throughput microfiele IC-methoden om de diversiteit van de celpopulatie en cel-celinteracties te bestuderen. In deze context stellen gelmicrodruppels ons in staat om nuttige protocolstappen uit te voeren, zoals lysis-kleuring DNA-manipulatie en microscopie op een sterk verlamde manier in opgesloten cellen. Microfiele workflows met druppeltjes staan bekend om hun ultrahoge doorvoer en veelzijdigheid, maar de acceptatie wordt vaak beperkt door de behoefte aan hoogwaardige instrumentatie en gespecialiseerde expertise.
Ons protocol verbetert traditionele technieken met behulp van high-throughput, single-cell analyse met fluorescerende kleuring en een toegankelijke open-source microscopieworkflow. Het kapselt cellen in gelmicrodruppels in via microfluïdica om minicellen en microkolonies tegelijkertijd te analyseren. Hoewel bulk- en plaatculturen specificiteit en resolutie missen, levert deze methode nauwkeurige en representatieve statistieken op van diverse verschijnselen.
Onze protocollen combineren druppelmicrofluïdica, fluorescentiemicroscopie en open-source hardware in een op labels gebaseerde methode. Deze aanpak maakt analyse van afzonderlijke cellen flexibeler en betaalbaarder, waardoor de wetenschappelijke gemeenschap complexe wetenschappelijke vragen over microbiële gemeenschappen kan beantwoorden. Verwarm om te beginnen agarose met ultra-lage geleren in een concentratie van 2% tot 90 graden Celsius in Luria Bertani, of LB-bouillon.
Schud het mengsel gedurende 10 minuten in een temperatuurgecontroleerde shaker en verlaag vervolgens de temperatuur van de thermoshaker tot 39 graden Celsius om de agarose-oplossing af te koelen. Plaats de Escherichia coli suspensiebuis gedurende vier minuten in de thermoshaker om deze op te warmen tot 39 graden Celsius. Meng de bacteriënsuspensie en agarose-oplossing in een één-op-één-verhouding om een agaroseconcentratie van 1% te bereiken met een celsuspensie van 3,1 keer 10 tot de macht van zes cellen per milliliter.
Bereid de negatieve controleoplossing voor voor contaminatiebewaking met behulp van LB en agarosesuspensie in een één-op-één-verhouding. Verkrijg het volledige open-source debietplatform, inclusief gasdrukdrivers en debietsensoren. Voeg een glazen dia en pipettipverwarmers toe aan de opstelling om de temperatuur van het agarosecelmonster te regelen wanneer het de chip binnenkomt.
Plaats vervolgens de microfluïdische chip op de stroboscoopversterkte microscopietrap en zorg ervoor dat de druppelgeneratiejunctie zichtbaar is. Stel de pipetpuntverwarmer en de glazen schuifverwarmer in op 40 graden Celsius met behulp van de besturingssoftware-interface. Laad met behulp van een spuit met slang en een PDMS-plug 1% agarosecelsuspensiemengsel in een pipetpunt van 200 microliter.
Steek de punt in de tipverwarmer en plaats deze op de inlaat van de waterige fase in de microfluïdische chip. Vervang de PDMS-afdichting van de tip door de afdichting die is aangesloten op de slang van het stroomregelsysteem. Steek vervolgens de olieslang in de tweede inlaat en het uiteinde van de uitlaatslang in een afvoerbuis.
Stel vervolgens de druk in op 80 millibar voor de berustings- en oliefasen op de gebruikersinterface en start de infusie van de celsuspensie en olie. Stel de oliefase in op 320 millibar en de berustingsfase op 180 millibar. Wacht een minuut om de druppelvorming te stabiliseren.
Zodra de druppelvorming stabiliseert, brengt u de afvoerslang van de afvoerslang over naar de opvangbuis. Ga door met het verzamelen van druppels op ijs totdat het monsterreservoir leeg is. Plaats de buisjes na het verzamelen een uur op vier graden Celsius om de agarosegel in de druppels te laten zitten.
Incubeer de gelmicrodruppeltjes met bacteriën en de negatieve controledruppels bij 37 graden Celsius gedurende vier uur of een nacht voor koloniegroei. Gebruik na de incubatie een spuit van drie milliliter met een naald van 21 gauge om voorzichtig zoveel mogelijk olie van de basis van de gelmicrodruppelemulsie te verwijderen. Breng 50 microliter van de gelmicrodruppels over in een nieuwe microbuis en bewaar deze bij vier graden Celsius voor verdere druppelanalyse, voeg een één-op-één mengsel van gefluoreerde olie met PFO toe in een volume dat gelijk is aan de resterende emulsie.
Voeg vervolgens ongeveer 200 microliter 0,9% natriumchloridebuffer toe aan de emulsie. Draai het mengsel los en draai het kort naar beneden in een centrifuge met vaste snelheid. Verwijder voorzichtig de oliefase van de bodem van de vloeistofinterface en gooi 100 microliter natriumchloride-oplossing van de bovenkant weg.
Breng twee microliter gelmicrodruppels over in een objectglaasje van de beeldkamer en voeg vijf microliter gefluoreerde olie toe om een monolaag druppels te vormen voor een optimale beeldvorming. Activeer op de microscoop de witte LED-matrixverlichting van bovenaf voor helderveldbeeldvorming. Monteer de voorbereide dia.
Stel scherp op het monster om een monolaag druppels te lokaliseren en een helderveldbeeld vast te leggen. Pas vervolgens het filterwiel aan zodat het is uitgelijnd met het groene golflengtefilter. Schakel over naar de 470-nanometer LED voor excitatie en leg een fluorescerend beeld van de kolonies vast zonder het monster te verplaatsen.
Breng twee microliter van de met propidiumjodide bevlekte microgels over in een beeldkamerchip en voeg vijf microliter 0,9% natriumchlorideoplossing toe om een monolaag van microgels te vormen. Dicht de inlaat en uitlaat van de chip af om verdamping tijdens de beeldvorming te voorkomen. Pas het rode golflengte-intervalfilter aan voor beeldvorming met propidiumjodide en leg de helderveld- en fluorescerende beelden vast.
Celinkapseling in gelmicrodruppels werd bevestigd door helderveldmicroscopie, die uniforme druppeltjes met duidelijke ingekapselde cellen laat zien. Kolonies die plasmide-gecodeerde fluorescentie verloren, werden geïdentificeerd met behulp van fluorescentieratio-analyse. Van de 2.785 geanalyseerde kolonies verloren 100 kolonies fluorescentie, wat wijst op een plasmideverliespercentage van 3,6%
Overzicht
Deze studie presenteert een open-source microfluïdische workflow voor het analyseren van plasmide-retentie in bacteriën met behulp van fluorescentiemicroscopie. De methode maakt nauwkeurige kwantificering van plasmide-aanwezigheid in enkele-cel microkolonies mogelijk, die zijn ingekapseld in gelmicrodruppeltjes, en biedt een schaalbaar alternatief voor traditionele plaattelling.
Belangrijkste onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Microfluïdica
- Celbiologie
- Fluorescentiemicroscopie
Achtergrond
- Microfluïdische technieken maken hoogdoorvoer analyse van celpopulaties mogelijk.
- Traditionele methoden missen vaak specificiteit en resolutie.
- Gelmicrodruppeltjes bieden een veelzijdig platform voor enkele-cel analyse.
- Open-source benaderingen kunnen toegang tot geavanceerde methodologieën democratiseren.
Doel van het onderzoek
- Om een hoogdoorvoer methode te ontwikkelen voor het bestuderen van plasmide-retentie in bacteriën.
- Om de toegankelijkheid en betaalbaarheid van enkele-cel analysetechnieken te verbeteren.
- Om een schaalbaar alternatief te bieden voor traditionele kweekmethoden.
Gebruikte methoden
- Bereiding van agarose gelmicrodruppeltjes die bacteriële cellen bevatten.
- Gebruik van microfluïdica voor druppelgeneratie en manipulatie.
- Fluorescentiemicroscopie voor beeldvorming en kwantificering van plasmide-retentie.
- Analyse van koloniefluorescentie om plasmideverliessnelheden te bepalen.
Belangrijkste resultaten
- Bevestigde inkapseling van cellen in gelmicrodruppeltjes via brightfield microscopie.
- Identificeerde een plasmideverliessnelheid van 3,6% onder de geanalyseerde kolonies.
- Demonstreerde de effectiviteit van de open-source workflow voor hoogdoorvoer analyse.
- Bijdroeg aan nauwkeurige statistieken over plasmide-retentie in diverse bacteriële populaties.
Conclusies
- De ontwikkelde methode verbetert de studie van microbiële gemeenschappen.
- Het biedt een flexibele en betaalbare benadering voor enkele-cel analyse.
- Deze workflow kan worden toegepast door onderzoekers met verschillende niveaus van expertise.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Plasmid stability is a critical parameter in synthetic biology and microbial engineering, directly impacting the reliability of engineered strains in biopharma R&D. High-throughput, quantitative analysis of plasmid retention without antibiotic selection enables robust target validation and de-risks early discovery workflows. Open-source droplet microfluidics democratizes access to advanced single-cell analytics, supporting scalable portfolio decisions and translational continuity.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative interrogation of plasmid stability in engineered microbial populations.
- Supports functional validation of genetic constructs under selection-free conditions.
- Provides high-resolution data for mechanistic de-risking of synthetic circuits.
- Facilitates predictive confidence in strain performance for downstream applications.
Screening & Assay Development
- Prepares validated microbial systems for high-throughput screening workflows.
- Delivers reproducible, quantitative outputs for assay standardization.
- Enables parallel analysis of thousands of microcolonies, increasing statistical power.
- Supports scalable and reusable assay platforms for diverse genetic constructs.
Translational & Preclinical Research
- Aligns microbial system stability with translational biomarker strategies when relevant.
- Ensures continuity from discovery through preclinical validation by quantifying genetic retention.
- Reduces risk of late-stage failure due to plasmid instability in engineered strains.
- Provides mechanistic insights for predictive de-risking in translational workflows.
Pipeline & Workflow Integration
This open-source microfluidic workflow integrates into the discovery-to-preclinical continuum, enabling robust single-cell analytics from early target validation through assay development and translational research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying plasmid retention at single-cell resolution.
- Screening: Delivers reproducible, high-throughput assay outputs for reliable compound or construct evaluation.
- Analytics: Provides quantitative fluorescence-based measurements to compare genetic stability across conditions.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical phases by ensuring engineered strain fidelity.
- Enterprise Reuse: Offers a flexible, open-source platform adaptable to various genetic and microbial systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in engineered strain validation.
- Operational Value: Standardizes and scales single-cell analysis with accessible instrumentation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing robust genetic stability data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of microbial engineering projects.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidics, fluorescence microscopy, and microbial genetics.
- Needs open-source hardware for precise flow and temperature control.
- Demands cross-team standardization for reproducible data integration.
- Adaptable to various microbial models and genetic constructs with minimal modification.
- Limited by the need for fluorescence-based readouts and compatible imaging infrastructure.
