Name: Plasmidestabiliteitsanalyse met open-source druppelmicrofluïdica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-12-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: Leer plasmidestabiliteitsanalyse in bacteriën met open-source druppelmicrofluïdica en fluorescentiemicroscopie. Deze methode biedt een schaalbaar alternatief voor traditionele plaatcounting met hoge resolutie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Wein, T., Hülter, N. F., Mizrahi, I., Dagan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+of+plasmid+stability+under+non-selective+conditions+maintains+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Emergence of plasmid stability under non-selective conditions maintains antibiotic resistance.</a> Nat Commun. 10 (1), 2595(2019).</li>
<li>Rodríguez-Beltrán, J., DelaFuente, J., León-Sampedro, R., MacLean, R. C., Millán, ÁS. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+horizontal+gene+transfer%3A+The+role+of+plasmids+in+bacterial+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Beyond horizontal gene transfer: The role of plasmids in bacterial evolution.</a> Nat Rev Microbiol. 19 (6), 347(2021).</li>
<li>Wein, T., Dagan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmid+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Plasmid evolution.</a> Curr Biol. 30 (19), R1158-R1163 (2020).</li>
<li>Chen, S., Larsson, M., Robinson, R. C., Chen, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+and+convenient+measurement+of+plasmid+stability+in+lab+and+clinical+isolates+of+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Direct and convenient measurement of plasmid stability in lab and clinical isolates of E. coli.</a> Sci Rep. 7 (1), 4788(2017).</li>
<li>Rouches, M. V., Xu, Y., Cortes, L. B. G., Lambert, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+plasmid+system+with+tunable+copy+number%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A plasmid system with tunable copy number.</a> Nat Commun. 13 (1), 3908(2022).</li>
<li>Silva, F., Queiroz, J. A., Domingues, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+metabolic+stress+and+plasmid+stability+in+plasmid+DNA+production+by+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Adv%22%5BJournal%5D)">Evaluating metabolic stress and plasmid stability in plasmid DNA production by Escherichia coli.</a> Biotechnol Adv. 30 (3), 691-708 (2012).</li>
<li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+novel+pJRD215-derived+plasmids+using+chloramphenicol+acetyltransferase+%28cat%29+gene+as+a+selection+marker+for+Acidithiobacillus+caldus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Construction of novel pJRD215-derived plasmids using chloramphenicol acetyltransferase (cat) gene as a selection marker for Acidithiobacillus caldus.</a> PLoS ONE. 12 (8), e0183307(2017).</li>
<li>Moragues, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet-based+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Methods+Primers%22%5BJournal%5D)">Droplet-based microfluidics.</a> Nat Rev Methods Primers. 3 (1), 32(2023).</li>
<li>Vitalis, C., Wenzel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leveraging+interactions+in+microfluidic+droplets+for+enhanced+biotechnology+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Leveraging interactions in microfluidic droplets for enhanced biotechnology screens.</a> Current Opinion in Biotechnology. 82, 102966(2023).</li>
<li>Sinha, N., Subedi, N., Wimmers, F., Soennichsen, M., Tel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pipette-tip+based+method+for+seeding+cells+to+droplet+microfluidic+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A pipette-tip based method for seeding cells to droplet microfluidic platforms.</a> J Vis Exp. (144), e57848(2019).</li>
<li>Wenzel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open+hardware%3A+From+DIY+trend+to+global+transformation+in+access+to+laboratory+equipment%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Biol%22%5BJournal%5D)">Open hardware: From DIY trend to global transformation in access to laboratory equipment.</a> PLOS Biol. 21 (1), e3001931(2023).</li>
<li>Murillo, L. F. R., Wenzel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Welcome+to+the+journal+of+open+hardware%5BTitle%5D)+AND+%22J+Open+Hardware%22%5BJournal%5D)">Welcome to the journal of open hardware.</a> J Open Hardware. 1 (1), (2017).</li>
<li>Shin, J. H., Choi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open-source+and+do-it-yourself+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Sens+Actuators+B+Chem%22%5BJournal%5D)">Open-source and do-it-yourself microfluidics.</a> Sens Actuators B Chem. 347, 130624(2021).</li>
<li>Pryszlak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+of+gut+microbiome+strains+for+cultivation-free+genome+sequencing+using+droplet+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep+Methods%22%5BJournal%5D)">Enrichment of gut microbiome strains for cultivation-free genome sequencing using droplet microfluidics.</a> Cell Rep Methods. 2 (1), 100137(2021).</li>
<li>Pollak, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+loop+assembly%3A+open%2C+efficient+and+cross-kingdom+DNA+fabrication%5BTitle%5D)+AND+%22Biology%22%5BJournal%5D)">Universal loop assembly: open, efficient and cross-kingdom DNA fabrication.</a> Biology. 5 (1), (2020).</li>
<li>Volkmer, B., Heinemann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Condition-dependent+cell+volume+and+concentration+of+Escherichia+coli+to+facilitate+data+conversion+for+systems+biology+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Condition-dependent cell volume and concentration of Escherichia coli to facilitate data conversion for systems biology modeling.</a> PLoS ONE. 6 (7), e23126(2011).</li>
<li>Li, H., et al. Squid: Simplifying quantitative imaging platform development and deployment. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLi%2C+H+%22bioRxiv%22">bioRxiv</a>. , (2020).</li>
<li>Abate, A. R., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Faster+multiple+emulsification+with+drop+splitting%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Faster multiple emulsification with drop splitting.</a> Lab Chip. 11 (11), 1911-1915 (2011).</li>
<li>Lau, B. T. C., Malkus, P., Paulsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+quantitative+methods+for+measuring+plasmid+loss+rates+reveal+unexpected+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Plasmid%22%5BJournal%5D)">New quantitative methods for measuring plasmid loss rates reveal unexpected stability.</a> Plasmid. 70 (3), 353-361 (2013).</li>
<li>Oellermann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open+hardware+in+science%3A+The+benefits+of+open+electronics%5BTitle%5D)+AND+%22Integr+Comp+Biol%22%5BJournal%5D)">Open hardware in science: The benefits of open electronics.</a> Integr Comp Biol. 62 (4), 1061-1075 (2022).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1H,1H,2H,2H-Perfluoro-1-octanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>370533-25G</td><td>Voor het breken van emulsies</td></tr><tr><td>70% ethanol</td><td></td><td></td><td>Voor celpermeabilisatie</td></tr><tr><td>Agar-Agar</td><td>Winkler</td><td>9002-18-0</td><td></td></tr><tr><td>Biopsy Punch</td><td></td><td></td><td>0,75 mm en 1,8 mm</td></tr><tr><td>Blue LED transilluminator</td><td>IO Rodeo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Culture tube</td><td></td><td></td><td>15 mL</td></tr><tr><td>Desiccator</td><td></td><td></td><td>Met vacuümpomp</td></tr><tr><td>Disposabele beker</td><td></td><td></td><td>Voor het mengen van PDMS</td></tr><tr><td>Disposabele vork</td><td></td><td></td><td>Voor het mengen van PDMS</td></tr><tr><td>E. coli TOP10 strain</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FluoPi microscoop</td><td>https://github.com/wenzel-lab/FluoPi</td><td></td><td>Groen fluorescerend beeldvormingssysteem voor het analyseren van platen</td></tr><tr><td>Gefluoreerde olie</td><td>3M</td><td></td><td>Novec 7500</td></tr><tr><td>Glasplaatverwarmer</td><td>https://github.com/wenzel-lab/modular-microfluidics-workstation-controller/tree/master/module-heating-and-stirring</td><td></td><td>Voor het regelen van de temperatuur op 40 &deg;C van microfluïdische chip</td></tr><tr><td>Glasplaten</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hotplate</td><td>Mechanic</td><td></td><td>Voor het verdampen van Aquapel</td></tr><tr><td>Beeldanalysesoftware</td><td>Fiji/ImageJ</td><td></td><td>2.14.0/1.54f</td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Mundo Lab</td><td></td><td>MLAB Scientific / Voor het incuberen van platen en microgels&nbsp;</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td></td><td></td><td>Voor het reinigen van glasplaten</td></tr><tr><td>Kanamycine</td><td></td><td></td><td>100 ug/mL concentratie</td></tr><tr><td>L-vormige verspreider</td><td></td><td></td><td>Voor het verspreiden van bacteriën op agarplaten</td></tr><tr><td>Mastervorm</td><td></td><td></td><td>Chipontwerp op siliconen of glazen wafer</td></tr><tr><td>Microbuizen</td><td></td><td></td><td>2 mL</td></tr><tr><td>NaCl-oplossing</td><td></td><td></td><td>Natriumchloride 0,9% w/v</td></tr><tr><td>Open-source hardware strobe-verbeterde microscoopstandaard</td><td>https://github.com/wenzel-lab/flow-microscopy-platform</td><td></td><td>Voor helderveldmicroscopie</td></tr><tr><td>Petrischaal</td><td>Citotest</td><td>2303-1090</td><td>90 x 15 mm</td></tr><tr><td>Pipettipverwarmer</td><td>https://github.com/wenzel-lab/modular-microfluidics-workstation-controller/tree/master/module-heating-and-stirring</td><td></td><td>Voor het regelen van de temperatuur op 40 &deg;C van de pipettip</td></tr><tr><td>Plasmareiniger</td><td>Diener Electronic</td><td>117056</td><td>Voor het verbinden van PDMS met een glasplaat</td></tr><tr><td>Plasmid pCA_Odd1</td><td></td><td></td><td>Codeert voor sfGFP en kanamycine-resistentie</td></tr><tr><td>Polytetrafluorethyleen (PTFE) slang</td><td>Adtech Polymer Engineering Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Voorgemengd Luria Bertoni-medium</td><td>US Biological Life Science</td><td>L1520</td><td></td></tr><tr><td>Propidiumjodide (PI)</td><td></td><td></td><td>Voor kleuring</td></tr><tr><td>Raspberry Pi-gebaseerd druk- en stroomregelsysteem</td><td>https://github.com/wenzel-lab/modular-microfluidics-workstation-controller</td><td></td><td>Voor het regelen van druk en stroomsnelheden</td></tr><tr><td>Silicone-elastomerbasis</td><td>Sylgard</td><td></td><td>PDMS kit - 184 Silicone Elastomer Kit</td></tr><tr><td>Silicone-elastomerhardingsmiddel</td><td>Sylgard</td><td></td><td>PDMS kit - 184 Silicone Elastomer Kit</td></tr><tr><td>Spectrofotometer</td><td></td><td></td><td>Voor het meten van absorptie</td></tr><tr><td>SQUID-microscoop</td><td>https://github.com/wenzel-lab/SQUID-bioimaging-platform</td><td></td><td>Multi-fluorescentie beeldvormingssysteem voor het analyseren van gekleurde cellen</td></tr><tr><td>Steriele lus</td><td></td><td></td><td>Voor het plukken van een kolonie en het uitstrekken van plateren</td></tr><tr><td>Oplosmiddel</td><td>Sphere Fluidics</td><td></td><td>Pico-Surf</td></tr><tr><td>Spuiten</td><td>NIPRO</td><td></td><td>Met filters en slangen</td></tr><tr><td>Temperatuurgeregelde shaker</td><td>Mundo Lab</td><td></td><td>DLAB HCM100-Pro</td></tr><tr><td>Pincet</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultra-lage geleerde temperatuur agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2576-5G</td><td>Voor het genereren van hydrogelkralen</td></tr><tr><td>Waterafstotende oplossing (fluoroalkylsilaan)</td><td>Aquapel</td><td></td><td>Voor het behandelen van microkanalen van PDMS-apparaat</td></tr></tbody></table>

plasmidestabiliteitsanalyse met open-source druppelmicrofluïdica

Plasmid Stability Analysis with Open-Source Droplet Microfluidics

Plasmidestabiliteitsanalyse met open-source druppelmicrofluïdica

Plasmids play a vital role in synthetic biology by enabling the introduction and expression of foreign genes in various organisms, thereby facilitating ...

plasmid-stability-analysis-with-open-source-droplet-microfluidics

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Microfluïdische apparaten kunnen worden gebruikt om complexe natuurlijke processen in real-time en op het juiste fysieke schalen te visualiseren. We hebben een eenvoudige microfluïdische apparaat dat de belangrijkste functies van de natuurlijke poreuze media nabootst voor het bestuderen van de groei en het transport van bacteriën in de ondergrond.

Venster op een Microworld: Eenvoudig Microfluïdische Systemen voor het bestuderen van microbiële transport in poreuze media

Druppel op basis van microfluïdische platforms zijn veelbelovende kandidaten voor high throughput experimenten, omdat zij in staat zijn om goedkoop te genereren picoliter, self-gecompartimenteerde schepen op kHz tarieven. Door integratie met snelle, gevoelige en een hoge resolutie fluorescentie spectroscopische methoden, kunnen de grote hoeveelheden informatie uit die in deze systemen efficiënt kunnen worden geëxtraheerd, aangewend en gebruikt.

Fluorescentie detectiemethoden voor microfluïdische druppel platforms

We een eenvoudige methode om microfluïdische inrichtingen kunnen toepassen soortgelijke dynamische omstandigheden meerdere verschillende stammen produceren zonder de noodzaak van een clean room of zachte lithografie.

Een microfluïdische apparaat voor het bestuderen van meerdere, afzonderlijke stammen

Source: Hemmerich, J., et al. Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology. J. Vis. Exp. (2017).This video demonstrates the use of an automated microbioreactor to monitor bacterial growth and fluorescent protein secretion in response to varying media formulations. A genetically modified bacterium expressing a secretory fluorescent protein is cultured under antibiotic selection and inoculated into nutrient-varied wells. Real-time optical...

Monitoring Bacterial Growth in Distinct Media Formulations with an Automated Microbioreactor

In dit protocol wordt de fabricage, installatie en basisbediening van een microfluïdische picoliter bioreactor (PLBR) voor single-cel analyse van prokaryotische micro-organismen geïntroduceerd. Industrieel relevante micro-organismen werden geanalyseerd als bewijs van principe, waardoor inzichten in groeisnelheid, morfologie en fenotypische heterogeniteit over bepaalde tijdsperioden mogelijk werden, wat nauwelijks mogelijk is met conventionele methoden.

Microfluïdische Picoliter Bioreactor voor Microbiële Eéncellige Analyse: Fabricage, Systeemopstelling en Werking

We beschrijven een digitale eindpuntassay voor het kwantificeren van nucleïnezuren met een vereenvoudigde (analoge) uitlezing. We meten bulkfluorescentie van druppelgebaseerde digitale assays met behulp van een standaard qPCR-machine in plaats van gespecialiseerde instrumenten en bevestigen onze resultaten door middel van microscopie.

Eenvoudige Bulk uitlezing van Digital nucleïnezuur kwantificering Testen

Dit werk biedt een methode voor de fabricage van microfluidic druppel gebaseerde platforms en de toepassing van polyacrylamide microsferen voor microsfeer-PCR versterking. De microsfeer-PCR-methode maakt het mogelijk om te verkrijgen van single-stranded DNA waarbij zonder te scheiden van de double-stranded DNA.

Een Droplet gebaseerde benadering van het Microfluidic en de microsfeer-PCR versterking voor Single-Stranded DNA waarbij

Onze experimentele aanpak biedt een strategie om plasmide overvloed en antibioticaresistentie na verloop van tijd te volgen in bacteriële populaties.

Kwantificering van plasmide gemedieerde antibioticaresistentie in een experimentele evolutie benadering

Het algemene doel van het protocol is om meer dan een miljoen geordende, uniforme, stabiele en biocompatibele femtoliter druppels voor te bereiden op een 1 cm2 vlakke substraat die kan worden gebruikt voor celvrije eiwitsynthese.

Een Femtoliter Droplet Array voor massively parallelle eiwitsynthese van enkele DNA-moleculen

De fabricage van een dubbellaags apparaat op basis van polydimethylsiloxaan (PDMS) voor de productie van combinatorische bibliotheken in water-in-olie-emulsies (pluggen) wordt hier gepresenteerd. De benodigde hardware en software die nodig zijn om de productie van stekkers te automatiseren, worden gedetailleerd beschreven in het protocol en de productie van een kwantitatieve bibliotheek van fluorescentiestekkers wordt ook gedemonstreerd.

Dubbellaags microfluïdisch apparaat voor de productie van combinatorische pluggen

Dit protocol biedt een standaard high-throughput screeningworkflow voor industriële micro-organismen. Het omvat het construeren van een mutantenbibliotheek via ARTP-mutagenese, het uitvoeren van positieve druppelscreening met geautomatiseerde microfluidica en vervolgens het verifiëren van de resultaten. De betrouwbaarheid van de workflow werd gevalideerd door het screenen van krachtige B. coagulans-stammen .

Hoogdoorvoerscreening van L-melkzuur-hyperproducerende bacilluscoagulansmutanten met behulp van een geautomatiseerd druppel-microflufluïdisch platform

Leer plasmidestabiliteitsanalyse in bacteriën met open-source druppelmicrofluïdica en fluorescentiemicroscopie. Deze methode biedt een schaalbaar alternatief voor traditionele plaatcounting met hoge resolutie.

Plasmidestabiliteitsanalyse met open-source druppelmicrofluïdica

Meer video's verkennen