Plasmidestabiliteitsanalyse met open-source druppelmicrofluïdica
27 december 2024
Een toegankelijke, open-source microfluïdische workflow wordt gepresenteerd voor de geparallelliseerde analyse van plasmideretentie in bacteriën. Door fluorescentiemicroscopie toe te passen om de aanwezigheid van plasmide in eencellige microkolonies in gelmicrodruppels te kwantificeren, biedt deze methode een nauwkeurig, toegankelijk en schaalbaar alternatief voor traditionele plaattelling.
We ontwikkelen high-throughput microfiele IC-methoden om de diversiteit van de celpopulatie en cel-celinteracties te bestuderen. In deze context stellen gelmicrodruppels ons in staat om nuttige protocolstappen uit te voeren, zoals lysis-kleuring DNA-manipulatie en microscopie op een sterk verlamde manier in opgesloten cellen. Microfiele workflows met druppeltjes staan bekend om hun ultrahoge doorvoer en veelzijdigheid, maar de acceptatie wordt vaak beperkt door de behoefte aan hoogwaardige instrumentatie en gespecialiseerde expertise.
Ons protocol verbetert traditionele technieken met behulp van high-throughput, single-cell analyse met fluorescerende kleuring en een toegankelijke open-source microscopieworkflow. Het kapselt cellen in gelmicrodruppels in via microfluïdica om minicellen en microkolonies tegelijkertijd te analyseren. Hoewel bulk- en plaatculturen specificiteit en resolutie missen, levert deze methode nauwkeurige en representatieve statistieken op van diverse verschijnselen.
Onze protocollen combineren druppelmicrofluïdica, fluorescentiemicroscopie en open-source hardware in een op labels gebaseerde methode. Deze aanpak maakt analyse van afzonderlijke cellen flexibeler en betaalbaarder, waardoor de wetenschappelijke gemeenschap complexe wetenschappelijke vragen over microbiële gemeenschappen kan beantwoorden. Verwarm om te beginnen agarose met ultra-lage geleren in een concentratie van 2% tot 90 graden Celsius in Luria Bertani, of LB-bouillon.
Schud het mengsel gedurende 10 minuten in een temperatuurgecontroleerde shaker en verlaag vervolgens de temperatuur van de thermoshaker tot 39 graden Celsius om de agarose-oplossing af te koelen. Plaats de Escherichia coli suspensiebuis gedurende vier minuten in de thermoshaker om deze op te warmen tot 39 graden Celsius. Meng de bacteriënsuspensie en agarose-oplossing in een één-op-één-verhouding om een agaroseconcentratie van 1% te bereiken met een celsuspensie van 3,1 keer 10 tot de macht van zes cellen per milliliter.
Bereid de negatieve controleoplossing voor voor contaminatiebewaking met behulp van LB en agarosesuspensie in een één-op-één-verhouding. Verkrijg het volledige open-source debietplatform, inclusief gasdrukdrivers en debietsensoren. Voeg een glazen dia en pipettipverwarmers toe aan de opstelling om de temperatuur van het agarosecelmonster te regelen wanneer het de chip binnenkomt.
Plaats vervolgens de microfluïdische chip op de stroboscoopversterkte microscopietrap en zorg ervoor dat de druppelgeneratiejunctie zichtbaar is. Stel de pipetpuntverwarmer en de glazen schuifverwarmer in op 40 graden Celsius met behulp van de besturingssoftware-interface. Laad met behulp van een spuit met slang en een PDMS-plug 1% agarosecelsuspensiemengsel in een pipetpunt van 200 microliter.
Steek de punt in de tipverwarmer en plaats deze op de inlaat van de waterige fase in de microfluïdische chip. Vervang de PDMS-afdichting van de tip door de afdichting die is aangesloten op de slang van het stroomregelsysteem. Steek vervolgens de olieslang in de tweede inlaat en het uiteinde van de uitlaatslang in een afvoerbuis.
Stel vervolgens de druk in op 80 millibar voor de berustings- en oliefasen op de gebruikersinterface en start de infusie van de celsuspensie en olie. Stel de oliefase in op 320 millibar en de berustingsfase op 180 millibar. Wacht een minuut om de druppelvorming te stabiliseren.
Zodra de druppelvorming stabiliseert, brengt u de afvoerslang van de afvoerslang over naar de opvangbuis. Ga door met het verzamelen van druppels op ijs totdat het monsterreservoir leeg is. Plaats de buisjes na het verzamelen een uur op vier graden Celsius om de agarosegel in de druppels te laten zitten.
Incubeer de gelmicrodruppeltjes met bacteriën en de negatieve controledruppels bij 37 graden Celsius gedurende vier uur of een nacht voor koloniegroei. Gebruik na de incubatie een spuit van drie milliliter met een naald van 21 gauge om voorzichtig zoveel mogelijk olie van de basis van de gelmicrodruppelemulsie te verwijderen. Breng 50 microliter van de gelmicrodruppels over in een nieuwe microbuis en bewaar deze bij vier graden Celsius voor verdere druppelanalyse, voeg een één-op-één mengsel van gefluoreerde olie met PFO toe in een volume dat gelijk is aan de resterende emulsie.
Voeg vervolgens ongeveer 200 microliter 0,9% natriumchloridebuffer toe aan de emulsie. Draai het mengsel los en draai het kort naar beneden in een centrifuge met vaste snelheid. Verwijder voorzichtig de oliefase van de bodem van de vloeistofinterface en gooi 100 microliter natriumchloride-oplossing van de bovenkant weg.
Breng twee microliter gelmicrodruppels over in een objectglaasje van de beeldkamer en voeg vijf microliter gefluoreerde olie toe om een monolaag druppels te vormen voor een optimale beeldvorming. Activeer op de microscoop de witte LED-matrixverlichting van bovenaf voor helderveldbeeldvorming. Monteer de voorbereide dia.
Stel scherp op het monster om een monolaag druppels te lokaliseren en een helderveldbeeld vast te leggen. Pas vervolgens het filterwiel aan zodat het is uitgelijnd met het groene golflengtefilter. Schakel over naar de 470-nanometer LED voor excitatie en leg een fluorescerend beeld van de kolonies vast zonder het monster te verplaatsen.
Breng twee microliter van de met propidiumjodide bevlekte microgels over in een beeldkamerchip en voeg vijf microliter 0,9% natriumchlorideoplossing toe om een monolaag van microgels te vormen. Dicht de inlaat en uitlaat van de chip af om verdamping tijdens de beeldvorming te voorkomen. Pas het rode golflengte-intervalfilter aan voor beeldvorming met propidiumjodide en leg de helderveld- en fluorescerende beelden vast.
Celinkapseling in gelmicrodruppels werd bevestigd door helderveldmicroscopie, die uniforme druppeltjes met duidelijke ingekapselde cellen laat zien. Kolonies die plasmide-gecodeerde fluorescentie verloren, werden geïdentificeerd met behulp van fluorescentieratio-analyse. Van de 2.785 geanalyseerde kolonies verloren 100 kolonies fluorescentie, wat wijst op een plasmideverliespercentage van 3,6%
Overzicht
Deze studie presenteert een open-source microfluidische workflow voor het analyseren van plasmidretentie in bacteriën met behulp van fluorescentiemicroscopie. De methode maakt een nauwkeurige kwantificering mogelijk van de aanwezigheid van plasmiden in microkolonies van enkelcellen die zijn ingekapseld in gel-microdruppels, wat een schaalbaar alternatief biedt voor traditionele plaattelmethoden.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Microfluidica
- Celbiologie
- Fluorescentiemicroscopie
Achtergrond
- Microfluïdische technieken maken high-throughput analyse van celpopulaties mogelijk.
- Traditionele methoden missen vaak specificiteit en resolutie.
- Gel-microdruppels bieden een veelzijdig platform voor single-cell analyse.
- Open-source benaderingen kunnen de toegang tot geavanceerde methodologieën democratiseren.
Doel van de studie
- Om een high-throughput methode te ontwikkelen voor het bestuderen van plasmidretentie in bacteriën.
- Om de toegankelijkheid en betaalbaarheid van single-cell analysetechnieken te verbeteren.
- Om een schaalbaar alternatief te bieden voor traditionele kweekmethoden.
Gebruikte methoden
- Bereiding van agarosegel-microdruppels met bacteriële cellen.
- Gebruik van microfluidica voor de generatie en manipulatie van druppels.
- Fluorescentiemicroscopie voor het afbeelden en kwantificeren van plasmidretentie.
- Analyse van koloniefluorescentie om plasmidverliespercentages te bepalen.
Belangrijkste resultaten
- Bevestigde inkapseling van cellen in gel-microdruppels via brightfield-microscopie.
- Stelde een plasmidverliespercentage van 3,6% vast onder de geanalyseerde kolonies.
- Demonstreerde de effectiviteit van de open-source workflow voor high-throughput analyse.
- Leverde nauwkeurige statistieken over plasmidretentie in diverse bacteriële populaties.
Conclusies
- De ontwikkelde methode verbetert de studie van microbiële gemeenschappen.
- Het biedt een flexibele en betaalbare benadering voor single-cell analyse.
- Deze workflow kan worden overgenomen door onderzoekers met verschillende niveaus van expertise.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Plasmidstabiliteit is een kritieke parameter in de synthetische biologie en microbiële engineering, die direct invloed heeft op de betrouwbaarheid van genetisch gemodificeerde stammen in biopharma R&D. High-throughput, kwantitatieve analyse van plasmidretentie zonder antibioticaselectie maakt robuuste targetvalidatie mogelijk en vermindert de risico's in vroege discovery-workflows. Open-source druppelmicrofluidica democratiseert de toegang tot geavanceerde single-cell analytics, wat schaalbare portfoliobeslissingen en translationele continuïteit ondersteunt.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt kwantitatieve analyse van de plasmidestabiliteit in gemanipuleerde microbiële populaties mogelijk.
- Ondersteunt functionele validatie van genetische constructen onder selectievrije condities.
- Biedt gegevens met een hoge resolutie voor mechanistische risicoreductie van synthetische circuits.
- Vergemakkelijkt de voorspellende betrouwbaarheid van de stamprestaties voor downstream-applicaties.
Screening & Assayontwikkeling
- Bereidt gevalideerde microbiële systemen voor voor high-throughput screening-workflows.
- Levert reproduceerbare, kwantitatieve resultaten voor assay-standaardisatie.
- Maakt parallelle analyse van duizenden microkolonies mogelijk, wat de statistische kracht verhoogt.
- Ondersteunt schaalbare en herbruikbare assay-platformen voor diverse genetische constructen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Stemt de stabiliteit van het microbiële systeem af op translationele biomarkerstrategieën wanneer dit relevant is.
- Garandeert continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie door de genetische retentie te kwantificeren.
- Vermindert het risico op falen in een laat stadium als gevolg van plasmidinstabiliteit in genetisch gemodificeerde stammen.
- Biedt mechanische inzichten voor voorspellende risicoreductie in translationele workflows.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze open-source microfluïdische workflow is geïntegreerd in het continuüm van ontdekking tot prekliniek, waardoor robuuste analyse op enkelcelniveau mogelijk wordt gemaakt, van vroege targetvalidatie tot assayontwikkeling en translationeel onderzoek.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetesten en pathway-verduidelijking door plasmideretentie op single-cell resolutie te kwantificeren.
- Screening: Levert reproduceerbare high-throughput assay-outputs voor een betrouwbare evaluatie van verbindingen of constructen.
- Analytics: Biedt kwantitatieve fluorescentiegebaseerde metingen om genetische stabiliteit tussen verschillende condities te vergelijken.
- Translationeel onderzoek: Slaat de brug tussen de ontdekkingsfase en de preklinische fasen door de getrouwheid van engineered stammen te waarborgen.
- Bedrijfsmatig hergebruik: Biedt een flexibel open-source platform dat aanpasbaar is aan diverse genetische en microbiële systemen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit bij de validatie van gemodificeerde stammen.
- Operationele waarde: Standaardiseert en schaalt enkelcelanalyse met toegankelijke instrumentatie.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen en kapitaalefficiëntie door het leveren van robuuste gegevens over genetische stabiliteit.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van microbiële engineeringprojecten mogelijk.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in microfluidica, fluorescentiemicroscopie en microbiële genetica.
- Vereist open-source hardware voor nauwkeurige controle van flow en temperatuur.
- Vereist standaardisatie tussen teams voor reproduceerbare gegevensintegratie.
- Aanpasbaar aan verschillende microbiële modellen en genetische constructen met minimale modificaties.
- Beperkt door de noodzaak van fluorescentiegebaseerde uitlezingen en een compatibele beeldvormingsinfrastructuur.
