Scheiding en fractionering van celwand- en celmembraaneiwitten van Mycobacterium tuberculosis voor stroomafwaartse eiwitanalyse

Ons onderzoek was gericht op het ontwikkelen van een gestroomlijnde methode om onoplosbare celwand- en celmembraaneiwitten van Mycobacterium tuberculosis te scheiden in eenvoudige fracties voor directe proteomische en immunologische testen. Vooruitgang in de elektroforetische technieken maakt het nu mogelijk om complexe eiwitten te scheiden in minder eiwitfracties, waardoor een efficiënte isolatie op basis van massaspecificaties voor functionele proteomische en immunologische toepassingen mogelijk wordt. De belangrijkste uitdagingen zijn onder meer de slechte oplosbaarheid van hydrofoob eiwit dat neerslaat van meer dan honderd milligram en door SDS-PAGE geïnduceerde denaturatie, die downstream-toepassing belemmert die native bevestiging nodig heeft, zoals enzymactiviteitstests.

Geen enkel huidig protocol scheidt systematisch onoplosbare hydrofobe celwand- en celmembraaneiwitten in gedefinieerde in water oplosbare fracties voor directe proteomische en immunologische analyse, wat essentieel is voor het begrijpen van de functie en het begeleiden van interventies. Ons toekomstig onderzoek zal zich richten op het ontwikkelen van diagnostiek op basis van T-celantigeen en het evalueren van hun gevoeligheid, specificiteit en prestaties in de tbc-populatie voor een vroege, nauwkeurige tbc-detectie met als doel een betere ziektebestrijding te ondersteunen. Verkrijg om te beginnen de celwand-, celmembraan- en cytosolische eiwitmonsters uit het hele cellysaat van Mycobacterium tuberculosis-bacillen.

Solubiliseren van de celwand en celmembraaneiwitten in iso-elektrische focusseringsbuffer. Voeg 2% amfolyten toe tussen een pH-bereik van 3 tot 10 en 4 tot 6 in een verhouding van één tot vier. Fractioneer nu de opgeloste eiwitten in een vloeibaar iso-elektrisch focusseringssysteem dat op vier graden Celsius wordt gehouden met een koelwaterbad.

Voer een scheiding tussen iso-elektrische focus uit volgens de instructies van de fabrikant door een constant vermogen van 12 watt toe te passen. Verzamel de afzonderlijke iso-elektrische focusseerfracties met een vacuümpomp. Bepaal de pH-waarden van elke fractie.

Onderwerp 50 microgram van de gescheiden fracties aan SDS-PAGE en visualiseer de eiwitten met behulp van Coomassie Brilliant Blue of zilverkleuring. Begin met het mengen van de IEF-gescheiden celwand- en celmembraanfracties met de SDS-gelelektroforesemonsterbuffer. Verwarm het mengsel vijf minuten op 95 graden Celsius.

Scheid de eiwitfracties in de tweede dimensie met behulp van polyacrylamidegels van 16 bij 20 centimeter met een 12,5% oplossende gel en een 4%stapelgel. Gebruik vervolgens een enkel monstertje van 13 centimeter lang om het monster op de gel te laden. Voer elektroforese uit met een constante stroom van 50 milliampère per gel totdat het verffront de bodem van de gel bereikt.

Breng na elektroforese de gel gedurende 10 minuten in evenwicht in elutiebuffer. Breng de gel over naar een heel gel-eluterapparaat volgens de instructies van de fabrikant van het instrument. Laat de eluter gedurende een uur met een constante stroom van 250 milliampère draaien om de eiwitten uit de gel te elueren en gebruik vervolgens een vacuümpomp om ongeveer 30 eiwitfracties, elk van drie milliliter, uit de gel te verzamelen.

Kwantificeer de eiwitconcentratie in de geëlueerde fracties met behulp van de bicinchoninezuur-eiwittest. Onderwerp 10 microgram van de geëlueerde eiwitfracties aan SDS-PAGE-analyse en visualiseer de banden door Coomassie Brilliant Blue-kleuring. Duidelijke eiwitbandpatronen werden waargenomen in de eerste supernatant:celwand-, celmembraan- en cytosolfracties van Mycobacterium tuberculosis, wat een succesvolle subcellulaire fractionering bevestigt.

De iso-elektrische focussering van celwandeiwitten vertoonde de hoogste eiwitconcentratie in fracties met een pH lager dan 2,5. SDS-PAGE van de celwand IEF-fracties onthulden verschillende eiwitbanden, voornamelijk in breuken 1 tot 8. Eiwitscheiding in het celmembraan door IEF onthulde grote eiwitconcentratiepieken tussen pH 4 en pH 10, waarbij de hoogste concentratie plaatsvond rond pH 10.

SDS-PAGE van de celmembraan IEF-fracties vertoonden diverse eiwitprofielen met duidelijkere banden in de fracties 1 tot en met 9. Preparatieve SDS-PAGE-scheiding van de IEF-opgeloste celwandeiwitten produceerde fracties die voornamelijk onder de 100 microgram per milliliter lagen. SDS-PAGE van de geëlueerde celwandeiwitfracties vertoonde een breed scala aan eiwitmolecuulgewichten, met meer geconcentreerde banden in de fracties 6 tot 10.

Preparatieve SDS-PAGE van celmembraaneiwitfracties onthulde dat meer dan de helft van de fracties eiwitconcentraties had tussen 50 en 199 microgram per milliliter. SDS-PAGE van de geëlueerde celmembraaneiwitfracties onthulde geconcentreerde banden in de banen 1 tot 8 en 13 tot 16.