Ruimtelijk compacte opstelling van larvale zebravissecties voor ruimtelijke transcriptomische analyse

In het Morhardt Lab gebruiken we zebravissen als diermodel om de ontwikkeling en functie van de blaas te bestuderen. We hebben een functionele urineblaas geïdentificeerd die zich vult en leegt in zebravissen. Hoewel zebravissen klein zijn, probeerden we gebruik te maken van hun grootte om economisch gebruik te maken van ruimtelijke transcriptomische technieken en ons begrip van de blaas van gewervelde dieren.

Ruimtelijke transcriptomische technieken kunnen snel duur worden als reagentia en apparatuur niet worden geoptimaliseerd. Dit protocol biedt een bewezen techniek om dit te bereiken met behulp van zebravissen en biedt inzicht in de verwachte resultaten en het beperken van problemen die kunnen ontstaan als gevolg van de technologie. Naast het economische gebruik van dure ruimtelijke transcriptomische technologieën, heeft dit werk ons in staat gesteld om grootschalige ruimtelijke transcriptomische analyses uit te voeren van in wezen hele organen over verschillende leeftijden, terwijl batcheffecten worden geminimaliseerd.

Koel om te beginnen de cryostaat af tot 22 graden Celsius en verzamel alle benodigde items. Bereid een plastic wegwerpmal voor op het uitlijnen van het monster. Plaats een stuk laboratoriumtape aan de binnenkant van de basismal en trek er een rechte lijn overheen met een permanente marker als referentiepunt.

Markeer de binnenkant van de basismal om de juiste monsteroriëntatie tijdens cryosectie te garanderen. Nadat u het mondstuk van de diepvriesmediumfles hebt gevuld, doseert u de benodigde hoeveelheid in een hoek van de basisvorm. Kantel de basisvorm langzaam om het medium gelijkmatig te verdelen.

Plaats nu de basisvorm met vriesmedium in een ijsbad en incubeer deze minimaal 10 minuten om het medium af te koelen. Voeg vervolgens een deel 100% ethanol toe aan een deel droogijs in een ijsemmer onder de zuurkast. Plaats de aluminium wegwerpschaal of boot in het ijsbad en dek de emmer vijf tot 10 minuten af.

Verzamel de geëuthanaseerde vissen nadat ze 10 minuten zijn ondergedompeld in water van vier graden Celsius. Pak met een tang met fijne punt de staartvin vast om de vis te verwijderen en druk deze voorzichtig tegen een absorberend pluisvrij doekje om hem te drogen. Plaats de voorbereide basisvorm onder een stereomicroscoop met een vergroting van 10x.

Plaats het monster in de mal langs het referentiepunt in de juiste richting. Bedek het monster voorzichtig met nog een dun laagje vriesmedium. Gebruik een anatomisch referentiepunt om de vis precies uit te lijnen met de gemarkeerde lijnen in de basisvorm en pas de oriëntatie aan met een tang met fijne punt, om luchtbellen te vermijden.

Breng een stuk droogijs aan op de bodem van de basisvorm onder het monster totdat het plaatselijk op zijn plaats is bevroren. Houd een horizontaal vlak aan om te voorkomen dat het monster verkeerd wordt uitgelijnd voordat het volledig bevriest. Plaats nu de basisvorm met het monster op de aluminium boot of schaal in het droogijs- en ethanolbad.

Zorg ervoor dat de boot aan de oppervlakte blijft drijven en dat de basismal droog blijft. Dek het bad af en laat de monsters 10 minuten bevriezen. Wikkel vervolgens de bevroren basisvorm in folie en bewaar deze in een vriezer op 80 graden Celsius tot hij klaar is om te worden gesneden.

Breng de bevroren basisvorm naar de voorgekoelde cryostaat voor cryosectie en plaats deze in de cryostaatkamer. Nadat u de ruimtelijke beeldglaasje uit de opslag hebt gehaald, plaatst u deze in een voorgekoelde objectglaasjeshouder. Bewaar de objectglaasjeshouder met het ruimtelijke beeldplaatje in de cryostaatkamer van 22 graden Celsius tot u klaar bent voor het verzamelen van secties.

Haal nu het bevroren monster uit de basisvorm en plaats het in een klauwplaat met vers vriesmedium, waarbij u ervoor zorgt dat het snijoppervlak naar het microtoommes wijst. Plaats vervolgens een vers fijn microtoommes in de cryostaat. Nadat u de mal op het mes hebt uitgelijnd, snijdt u het interessegebied bij met een aanbevolen dikte van 20 tot 50 micrometer.

Zorg ervoor dat de markeringen in de mal worden overgebracht naar het bevroren blok voor de juiste oriëntatie van het monster. Pas de mal tijdens het bijsnijden zo aan dat het snijvlak evenwijdig blijft aan de referentiemarkeringen in het vriesmedium. Snijd secties van het bevroren blok en verzamel ze op een standaard positief geladen microscoopglaasje.

Controleer de secties onder een helderveldmicroscoop om te bevestigen dat het bijsnijden is voltooid. Verwijder vervolgens het objectglaasje voor ruimtelijke beeldvorming uit de cryostaatkamer en plaats het in een ijsbad van vier graden Celsius, terwijl u het in de objectglaasjeshouder houdt. Begin met cryosectie bij een aanbevolen dikte van 10 tot 14 micrometer.

Verzamel secties op positief geladen dia's totdat het interessegebied is bereikt. Haal nu het eencellige ruimtelijke beeldplaatje uit het ijsbad en verwijder het glaasje uit de houder. Verzamel secties rij voor rij met behulp van een penseel met fijne punt om rollen te voorkomen.

Druk vervolgens met de achterkant van een penseel een hoek van het lege vriesmiddel op de mestrap. Gebruik de bovenkant van de slede als draaipunt en laat de slede langzaam op het gedeelte zakken om hem drie seconden te laten hechten voordat hij wordt opgetild. Lijn seriële secties evenwijdig aan elkaar om de ruimte op de dia te maximaliseren.

Nadat u secties uit het interessegebied hebt verzameld, plaatst u de dia terug in de diahouder. Als er geen monsters meer nodig zijn, bewaar het objectglaasje dan maximaal twee weken bij 80 graden Celsius voordat u het analyseert. Verzamel secties voor en na het interessegebied op een standaard positief geladen microscoopglaasje en voer hematoxyline- en eosinekleuring uit om de uitlijning van het monster en de kwaliteit van de secties te beoordelen voordat u doorgaat met de analyse.

De uitlijning van meerdere secties werd geverifieerd door structuren over secties in dezelfde snede te vergelijken. Aanpassingen aan de inbeddings- en verzamelingsstappen zorgden ervoor dat een groter aantal secties binnen het beeldvormingsgebied van een ruimtelijke transcriptomische dia paste. De ruimtelijke transcriptomische signaalkwaliteit was hoog in weefselgebieden, maar lager in lege dia's vanwege de lage signaalcomplexiteit.