In situ Isolatie en kweek van weerbarstige bodembacteriën met behulp van een isolatiechip (iChip)

Er bestaan rijke opslagplaatsen van microben in diverse natuurlijke omgevingen, zoals bodem, waterlichamen en extreme omgevingen. Het aanboren van deze enorme biodiversiteit wordt echter grotendeels beperkt door laboratoriummethoden en media. Door deze cultuurbarrière te doorbreken en deze biodiversiteit aan te boren, heeft het het potentieel om aan verschillende biotechnologische behoeften te voldoen en wereldwijde uitdagingen op te lossen.

De ontwikkeling van antimicrobiële resistentie is bijvoorbeeld gericht op de wereldwijde volksgezondheid. Bodembacteriën die in het laboratorium moeilijk te kweken zijn, kunnen nieuwe bioactieve stoffen produceren met krachtige antimicrobiële activiteit die waardevol kunnen zijn bij het aanpakken van de wereldwijde uitdaging van antimicrobiële systemen. De enorme verscheidenheid aan microben in de omgeving en hun product is niet onderzocht, aangezien traditionele op laboratoriumcultuur gebaseerde technologieën vaak leiden tot de isolatie van vergelijkbare bekende microben. Het doel van dit experiment is om high-throughput cultuur van recalcitrante bodembacteriën in-situ te demonstreren met behulp van IChip-technologie. In dit protocol demonstreren we de constructie en het gebruik van deze IChip-technologie die kan worden gebruikt voor high-throughput in-situ kweek van moeilijk te kweken bacteriën en het herstel van antimicrobieel producerende bacteriën als toepassing van deze technologie.

[Presentator] Maak om te beginnen een voorlopig ontwerp van de boven-, onder- en middenplaten van de isolatiechip in presentatiesoftware. Gebruik de optie voor het invoegen van vormen in de presentatiesoftware om cirkels van noodzakelijkerwijs afmetingen in te voegen om als IChip te dienen. Voeg kleinere cirkels toe om IChip-kanalen weer te geven. Schik de kleinere cirkels in het gewenste patroon om een voorlopig ontwerp voor te bereiden voor de boven-, onder- en middenplaat van de IChip. Selecteer het ontwerp en gebruik het rechtsklikmenu om het voorlopig ontwerp als afbeelding op te slaan. Gebruik het voorlopige ontwerp als sjabloon om een tweedimensionaal ontwerp te maken met behulp van computerondersteunde ontwerpsoftware. Voeg vanuit het schetsmenu vooraf gedefinieerde vormen in, voornamelijk cirkels, om het basisontwerp voor de IChip-platen en het gebied van de kanalen te maken. Gebruik de dimensieoptie om de werkelijke afmetingen van de platen en kanalen in te stellen. Klik op OK om het ontwerp af te ronden en gebruik vervolgens de extrude-functie om het 2D-ontwerp om te zetten naar een 3D-model van de gewenste dikte. Gebruik ten slotte het bestandsmenu om een kopie van het 3D-model op te slaan in het stilstaande lithografiebestandsformaat dat compatibel is voor 3D-printen.

[Presentator] Verzamel alle essentiële items die nodig zijn voor het verzamelen van grondmonsters en bereik de locatie waar het monster moet worden verzameld. Open de mobiele applicatie voor geocodering en zoek het unieke adres van drie woorden van de bemonsteringslocatie en noteer het. Noteer vervolgens relevante metagegevens van het monster, zoals de temperatuur, datum, tijd, diepte van de bemonstering, het weer en de blootstelling van de locatie aan de elementen. Spuit een schop en de piepschuimkist waarin de IChip geplant moet worden in met 70% ethanol. Veeg ze schoon met tissuepapier en laat de ethanol volledig aan de lucht drogen. Gebruik vervolgens de ontsmette schop om al het oppervlaktepuin op te ruimen, zoals bladafval of rotsen om de bovengrond bloot te leggen. Ontsmet de schop opnieuw zoals voorheen. Gebruik de schop om toegang te krijgen tot de grond op een diepte van drie tot zes inslikken onder de ondergrond en breng ongeveer vier tot vijf kg grond van een uniforme diepte over in de polystyreendoos. De doos moet voor ongeveer 75% gevuld zijn. Transporteer de verzamelde grond direct terug naar het laboratorium. Weeg van het verzamelde grondmonster één gram grond vrij van puin, steen en bladafval af in een steriele centrifugebuis van 50 mil met 10 ml steriele zoutoplossing. Meng de grond met de zoutoplossing terwijl je ongeveer 10 seconden vortext om een bodemsuspensie te creëren. Laat de centrifugebuis vijf minuten ongemoeid om de grote gronddeeltjes in de buis te laten bezinken. Breng vervolgens de bovenstaande grondsuspensie voorzichtig over naar een verse reageerbuis met het label S. Gebruik de grondsuspensie als het onverdunde monster en voer een nulverdunning uit door één ml van het monster over te brengen in negen ml steriele zoutoplossing in een verse buis. Bereid verdunning voor van 10 is tot macht min één tot 10 is tot macht min vijf. Ontsmet in een bioveiligheidskast het oppervlak de bovenplaat, bodemplaat en middenplaat van de IChip door deze gedurende 10 minuten in 70% ethanol te weken. Spoel de overtollige ethanol af door de IChip-componenten te wassen met steriel gedeïoniseerd water en laat ze een steriel petrischaaltje aan de lucht drogen. Plaats de middelste plaat van de IChip in een steriel petrischaaltje, klaar om te zaaien. Smelt het SMS-agarmedium in een magnetron. Laat het afkoelen en breng vervolgens 22,5 ml SMS-agar bij 45 graden over in een steriele centrifugebuis van 50 ml. Voeg hieraan 2,5 ml van een geschikte verdunning van het grondmonster toe en meng goed door zachte inversie zonder het binnenbrengen van luchtbellen te vermijden. Giet langzaam ongeveer drie tot vier ml van het gezaaide SMS-agarmedium over de middelste plaat van de IChip en bedek het hele oppervlak. Laat het SMS-agarmedium vervolgens ongeveer vijf tot 10 minuten opstijven. Controleer of het SMS-agarmedium is ingesteld. Schraap vervolgens met het steriele scheermesje de overtollige SMS-agar van het oppervlak van de IChip-metalen plaat en laat de agarpluggen in de afzonderlijke diffusiekamers achter. Nadat u het beschermvel van een van de 0,03 micrometer polycarbonaat membraanfilters hebt verwijderd, plaatst u het voorzichtig aan de binnenkant van het bovenblad van de IChip met behulp van een steriele tang. Plaats vervolgens met een steriele tang nog een polycarbonaat membraanfilter van 0,03 micrometer op de blootgestelde zijde van de gezaaide metalen plaat. Plaats de boven- en onderplaten van de IChip, tussen de middelste plaat, en de polycarbonaat membranen, en zorg ervoor dat deze schroefgaten in alle platen worden uitgelijnd om de IChip-assemblage te voltooien. Draai de moeren en bouten stevig vast om de IChip-eenheid vast te zetten. Maak met een steriele schop een holte die groter is dan de grootte van de IChip in de grondopvangbak in de piepschuimdoos. Plant de IChip-constructie verticaal in de holte en vul deze stevig met aarde en zorg ervoor dat alle oppervlakken van de IChip volledig bedekt zijn. Laat vervolgens in-situ in cultuur voor de gewenste duur van twee tot vier weken. Gebruik tijdens de incubatie periodiek steriel gedestilleerd water om de bodemomgeving, de geplante IChip, te bevochtigen om te voorkomen dat de gezaaide SMS-agarpluggen in de diffusiekamer uitdrogen. Maak na de gewenste incubatie de grond rond de geplante IChip voorzichtig los om deze te herstellen. Was de IChip vervolgens met steriele zoutoplossing om aanhangende gronddeeltjes te verwijderen en breng deze over in een bioveiligheidskast voor verdere verwerking. Draai de bouten en moeren van de IChip los en demonteer de IChip voorzichtig. Verwijder met een steriele tang de polycarbonaat membranen en breng de middelste plaat van de IChip over in de voorbereide petrischaal. Gebruik een steriele houten applicator om de afzonderlijke agarpluggen in elke diffusiekamer terug te winnen. Inoculeer de agar-pluggen in de juiste media zoals SMS-agar of 0.1X Tryptic Soy Broth Agar om laboratoriumteelt te proberen. Gecultiveerde isolaten kunnen vervolgens worden gescreend op antimicrobiële productie door middel van routinemethoden, zoals agar-overlay met behulp van testerstammen. Hier tonen we representatieve screeningsresultaten voor 12 culturen, IC-1 tot en met 12 verkregen uit IChip-agarpluggen tegen Staphylococcus aureus ATCC 29213 en Acinetobacter baumannii B8342. Merk op dat culturen IC-6 en IC-8 activiteit vertonen tegen respectievelijk grampositieve en gramnegatieve testerstammen. U kunt ook de teruggevonden agarpluggen die in-situ gekweekte recalcitrante bodembacteriën bevatten, kleuren en afbeelden om de groei van microkolonies onder in-situ omstandigheden te bevestigen. Met deze aanpak is het mogelijk om recalcitrante bodembacteriën ter plaatse te herstellen op een manier met een hoge doorvoer. De 3D-geprinte IChip biedt plaats aan 156 agarpluggen. Het is echter noodzakelijk om tijdens het zaaien de juiste verdunning te kiezen om ervoor te zorgen dat één bacteriecel in elk kanaal van de IChip wordt gezaaid. De benodigde bacteriën kunnen vervolgens worden gescreend op gewenste bioactiviteiten, zoals metabolietproductie, enzymproductie, biopolymeerproductie, enzovoort, als ze in de laboratoriumomstandigheden kunnen worden gekweekt. Het is echter ook waarschijnlijk dat sommige bacteriën niet groeien in laboratoriumomstandigheden, en in dergelijke gevallen moeten we mogelijk metagenomische benaderingen toepassen om de microbiële aanwezigheid te realiseren en toegang te krijgen tot hun biosynthetisch potentieel. De beschreven methode is zeer eenvoudig en kan gemakkelijk worden gebruikt voor bioprospectie van microben in diverse omgevingsomstandigheden met kleine aanpassingen.