Name: Volumetrische beeldvorming en analyse van primaire trilharen in musculoskeletaal weefsel met behulp van het ARL13B-CENTRIN-2-muismodel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-28T13:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: Leer volumetrische beeldvorming van primaire trilharen in het ARL13B-CENTRIN-2-muismodel voor ontwikkelingsbiologie. Deze methode maakt 3D-analyse van trilhaarorganisatie in groeischijfweefsel mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Wheatley, D. N., Wang, A. M., Strugnell, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+primary+cilia+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol+Int%22%5BJournal%5D)">Expression of primary cilia in mammalian cells.</a> Cell Biol Int. 20 (1), 73-81 (1996).</li>
<li>Donnelly, E., Ascenzi, M. G., Farnum, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+cilia+are+highly+oriented+with+respect+to+collagen+direction+and+long+axis+of+extensor+tendon%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Res%22%5BJournal%5D)">Primary cilia are highly oriented with respect to collagen direction and long axis of extensor tendon.</a> J Orthop Res. 28 (1), 77-82 (2010).</li>
<li>McGlashan, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+loading+modulates+chondrocyte+primary+cilia+incidence+and+length%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol+Int%22%5BJournal%5D)">Mechanical loading modulates chondrocyte primary cilia incidence and length.</a> Cell Biol Int. 34 (5), 441-446 (2010).</li>
<li>Farnum, C. E., Wilsman, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orientation+of+primary+cilia+of+articular+chondrocytes+in+three-dimensional+space%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec%22%5BJournal%5D)">Orientation of primary cilia of articular chondrocytes in three-dimensional space.</a> Anat Rec. 294 (3), 533-549 (2011).</li>
<li>Coveney, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ciliary+protein+IFT88+controls+post-natal+cartilage+thickness+and+influences+development+of+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Arth+Rheumatol%22%5BJournal%5D)">The ciliary protein IFT88 controls post-natal cartilage thickness and influences development of osteoarthritis.</a> Arth Rheumatol. 74 (1), 49-59 (2021).</li>
<li>Coveney, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciliary+IFT88+protects+coordinated+adolescent+growth+plate+ossification+from+disruptive+physiological+mechanical+forces%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Miner+Res%22%5BJournal%5D)">Ciliary IFT88 protects coordinated adolescent growth plate ossification from disruptive physiological mechanical forces.</a> J Bone Miner Res. 37 (6), 1081-1086 (2022).</li>
<li>Andrea, C. E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+cilia+organization+reflects+polarity+in+the+growth+plate+and+implies+loss+of+polarity+and+mosaicism+in+osteochondroma%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Primary cilia organization reflects polarity in the growth plate and implies loss of polarity and mosaicism in osteochondroma.</a> Lab Invest. 90 (7), 1091-1101 (2010).</li>
<li>Ascenzi, M. -G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+localization%2C+length+and+orientation+of+chondrocytic+primary+cilium+on+murine+growth+plate+organization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Theor+Biol%22%5BJournal%5D)">Effect of localization, length and orientation of chondrocytic primary cilium on murine growth plate organization.</a> J. Theor Biol. 285 (1), 147-155 (2011).</li>
<li>Bangs, F. K., Schrode, N., Hadjantonakis, A. K., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+specificity+of+primary+cilia+in+the+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Lineage specificity of primary cilia in the mouse embryo.</a> Nat. Cell Biol. 17 (2), 113-122 (2015).</li>
<li>Larkins, C. E., Aviles, G. D. G., East, M. P., Kahn, R. A., Caspary, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arl13b+regulates+ciliogenesis+and+the+dynamic+localization+of+Shh+signaling+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Arl13b regulates ciliogenesis and the dynamic localization of Shh signaling proteins.</a> Mol Biol Cell. 22 (23), 4694-4703 (2011).</li>
<li>Higginbotham, H., Bielas, S., Tanaka, T., Gleeson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+mouse+line+with+green-fluorescent+protein-labeled+Centrin+2+allows+visualization+of+the+centrosome+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Res%22%5BJournal%5D)">Transgenic mouse line with green-fluorescent protein-labeled Centrin 2 allows visualization of the centrosome in living cells.</a> Transgenic Res. 13 (2), 155-164 (2004).</li>
<li>arivis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Application+Note+%2347+-+Applying+Cellpose+models+in+arivis+Vision4D%22">Application Note #47 - Applying Cellpose models in arivis Vision4D</a>. , 1-20 (2021).</li>
<li>Huff, J., Bergter, A., Luebbers, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+Note%3A+Multiplex+mode+for+the+LSM+9+series+with+Airyscan+2%3A+fast+and+gentle+confocal+super-resolution+in+large+volumes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Application Note: Multiplex mode for the LSM 9 series with Airyscan 2: fast and gentle confocal super-resolution in large volumes.</a> Nat Methods. , (2019).</li>
<li>Ning, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cilia-associated+wound+repair+mediated+by+IFT88+in+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Cilia-associated wound repair mediated by IFT88 in retinal pigment epithelium.</a> Sci Rep. 13 (1), 8205-8219 (2023).</li>
<li>Palla, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+cilia+on+muscle+stem+cells+are+critical+to+maintain+regenerative+capacity+and+are+lost+during+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Primary cilia on muscle stem cells are critical to maintain regenerative capacity and are lost during aging.</a> Nat Commun. 13 (1), 1439-1451 (2022).</li>
<li>Brewer, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postnatal+dynamic+ciliary+ARL13B+and+ADCY3+localization+in+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Postnatal dynamic ciliary ARL13B and ADCY3 localization in the mouse brain.</a> Cells. 13 (3), 259-277 (2024).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>22 x 50 mm dekglasjes</td><td>fisherscientific&nbsp;</td><td>12373128</td><td></td></tr><tr><td>arivis Vision4D software</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td>Beeldanalysesoftware&nbsp;</td></tr><tr><td>Confocal laser scanning microscoop&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>Zeiss 980 Airyscan 2</td><td></td></tr><tr><td>CoverGrip Dekglaskleefstof&nbsp;</td><td>Biotium&nbsp;</td><td>23005</td><td></td></tr><tr><td>Cryofilm type 3C(16UF) (bladtype) 2,0 cm breed</td><td>Section-lab</td><td>C-FUF303</td><td>Te kopen bij Section-lab direct</td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica</td><td>CM1900 UV</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Disponibel basisvormen&nbsp;</td><td>epredia</td><td>58952</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate Buffered Saline</td><td>gibco</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>Formaline</td><td>Sigma</td><td>20260630</td><td></td></tr><tr><td>Imaris software&nbsp;</td><td>Oxford Instruments&nbsp;</td><td>N/A</td><td>Beeldanalysesoftware voor 3D reconstructie&nbsp;</td></tr><tr><td>Dompelolie 518F</td><td>Zeiss</td><td>ISO 8036&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Microtoommessen</td><td>Feather</td><td>02.075.00.006</td><td></td></tr><tr><td>SlowFade Glass Antifade Mountant&nbsp;</td><td>invitrogen</td><td>S36917</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>Super Cryoembedding Medium (SCEM)</td><td>Section-lab</td><td>C-EM001</td><td>Te kopen bij Section-lab direct</td></tr><tr><td>Superfrost Plus Microscoopglazen</td><td>avantor</td><td>631-0108</td><td></td></tr><tr><td>Zen software</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td>Freeware voor confocale laser scanning microscopie</td></tr></tbody></table>

volumetrische beeldvorming en analyse van primaire trilharen in musculoskeletaal weefsel met behulp van het arl13b-centrin-2-muismodel

Volumetric Imaging and Analysis of Primary Cilia in Musculoskeletal Tissue using the ARL13B-CENTRIN-2 Mouse Model

Volumetrische beeldvorming en analyse van primaire trilharen in musculoskeletaal weefsel met behulp van het ARL13B-CENTRIN-2-muismodel

The primary cilium is a non-motile, solitary organelle assembled by most cell types. It is essential to the development and homeostasis of the skeleton ...

Om de groeiende ledematen beter te begrijpen, hebben we het primaire cillium bestudeerd, een orgaantje dat een sleutelrol speelt bij het reguleren van de reactie van cellen op hun omgeving. Om de rol van het cillium in groei te onderzoeken, beeldden we ze af in de groeiplaat, een laag kraakbeen waar nieuw bot groeit. Het primaire cillium is extreem klein, minder dan vijf micrometer lang, wat het moeilijk maakt om het te beeldhouwen, vooral in drie dimensies.Het beeldvormen ervan in matrixrijk, gedeeltelijk verkalkt weefsel, zoals kraakbeen en bot, maakt het nauwkeurig onderzoeken van hun aanwezigheid, laat staan positie, oriëntatie en grootte, nog moeilijker. We kunnen de 3D-organisatie van primaire cilia in alle cellen binnen de groeiplaat in kaart brengen en vragen of zieke cellen er een assembleren waar en hoe deze is georiënteerd met betrekking tot weefselmorfogenese. Primaire cilia zijn eerder alleen in 2D in groeiplaten of in zeer kleine aantallen bestudeerd.De endogene fluorescente signalen voor het cillium en de centriolen brengen vertrouwen in ciliaire identificatie vanwege de hoge signaal-ruisverhouding en vermijden de noodzaak van immunohistochemie. Dit protocol maakt ook hoogdoorvoerige collectieve beeldvorming van honderden cilia in het weefsel mogelijk, waardoor we cilia ruimtelijk kunnen relateren aan de morfogenesevenementen die we bestuderen. Deze beeldvormings- en analysemethodologie kan worden toegepast op andere weefsels om primaire cilia te kaarten over weefsels en organen.Dit zal een beter begrip mogelijk maken van het verband tussen primaire ciliastructuur en functie. Om te beginnen, neem de voorbereide bevroren cryosectie van het muisweefsel en plaats de glijbaan horizontaal bij kamertemperatuur om te ontdooien. Was de glijbaan met een druppel PBS gedurende drie cycli van vijf minuten elk om de sham te verwijderen.Breng 10-micromolar DAPI-oplossing aan op de glijbaan en kleur gedurende één minuut. Monteer vervolgens het monster, dek het af met een dekglas en laat het een nacht bij kamertemperatuur staan. Verzegeld de randen van het dekglas met dekglassealer.Om de confocale microscoop in te stellen, zet hem aan, open de software en klik op de System-knop. Onder het tabblad Acquisitie, klik op Smart Setup om de kanalen in te stellen en voeg de GFP-, mCherry- en DAPI-kanalen toe. Selecteer vervolgens de ARI Scan-optie en de sR8-Y-functie vanuit de ARI-scan driehoek tussen resolutie en snelheid.Klik op Beste Signaal en vervolgens op OK om te bevestigen. Selecteer in het tabblad Lokaliseren onder Microscoopbesturing het 40-voudig en 1.4 objectief met olie-immersie. Plaats vervolgens de glijbaan in de glijbaanhouder en breng het objectief omhoog totdat de olie het dekglas raakt.Plaats vervolgens de groeiplaat of een andere regio van belang onder de lichtbundel. Klik in het tabblad Lokaliseren op Fluorescentie en selecteer DAPI. En gebruik het oculair om de glijbaanhouder met de joystick te verplaatsen om de groeiplaat of regio van belang onder het gezichtsveld te positioneren.Selecteer in het tabblad Acquisitie alleen het DAPI-kanaal. Klik op Continu om het beeld van het DAPI-kanaal op het scherm te bekijken en ervoor te zorgen dat de groeiplaat zichtbaar is. Om de tegelweergave te openen, klik op Toon Weergave in het tabblad Tegels.Voeg het vereiste aantal tegels toe, meestal één tegel in de X-richting en drie tot vijf tegels in de Y-richting. Klik vervolgens op Voorbeeld en Start. Controleer nu of de tegels de drie zones van de groeiplaat bedekken, rustend, proliferatie en hypertrofisch.Pas de tegelpositie en het aantal indien nodig aan. Om de beeldparameters in te stellen, klikt u in het tabblad Acquisitie op Continu. Om de ARI-scandetector uit te lijnen, opent u het venster voor aanpassing van de ARI-scandetector door op het symbool met betegelde rozet aan de onderkant te klikken.Wacht tot alle tegels groen worden. Pas in het tabblad Kanalen de mastergain en laservermogen aan om de kernen duidelijk op het scherm te kunnen bekijken. Selecteer vervolgens alle drie de kanalen en klik op Continu om met beeldvorming te beginnen.Laat de ARI-scandetector uitlijnen. Definieer in het tabblad Acquisiemodus de beeldgrootte, pixelgrootte, framegrootte, snelheid en gemiddelde waarden. Selecteer in het tabblad Acquisitie het selectievakje Z-Stack om Z-stack-beeldvorming in te schakelen.Selecteer vervolgens alleen het DAPI-kanaal en klik op Continu om het beeld op het scherm te bekijken. Beweeg het objectief naar de dichtstbijzijnde te beelden vlak. Klik in het tabblad Z-Stack op Eerste Vlak Instellen, focus dan weg naar het laatste vlak om te bekijken, en klik op Laatste Vlak Instellen om het beeldvormingsbereik te configureren.Stel het interval tussen Z-stack-vlakken in op 0,15 micrometer. Beweeg naar het midden van het Z-stack-beeldvormingsbereik. Klik in het tabblad Tegels onder Tegelregio's op Verifiëren en vervolgens op Z Instellen en Naar Volgende Verplaatsen.Bevestig nu in het tabblad Focusstrategie dat de focusstrategie is ingesteld om Z-waarden te gebruiken en de focusoppervlakte gedefinieerd in de tegelsetup. Klik vervolgens op Start Experiment om met beeldverwerving te beginnen. Om de beelden te verwerken, gaat u naar het tabblad Verwerking, selecteert u Enkelvoudige of Batchmodus, selecteert u ARI Scan Verwerking, vinkt u de optie 3D Verwerking aan en selecteert u Standaard Auto Filter.Kies het verworven ruwe beeld en start de verwerking. Selecteer na het voltooien van de ARI-scanverwerking Stiksel in de verwerkingsmethoden. Kies Nieuwe Output, Tegels Fuseren, Schaduwcorrectie en Alles door Referentie met de referentie ingesteld op DAPI.Selecteer het verwerkte ARI-scanbeeld en start het stikselproces. Importeer om te beginnen het verworven CZI-beeldbestand in de software en open het Analysepaneel. Selecteer in het vervolgkeuzemenu Nieuwe Pijplijn.Gebruik de kn

volumetric-imaging-analysis-primary-cilia-musculoskeletal-tissue

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Een eenvoudige en betrouwbare techniek voor het visualiseren en kwantificeren luchtwegen trilharen beweeglijkheid en trilharen gegenereerde stroom met behulp van de muis luchtpijp wordt beschreven. Deze techniek kan worden aangepast om te bepalen hoe een groot aantal factoren beïnvloeden cilia motiliteit, zoals farmacologische agentia, genetische factoren, omgevingsfactoren blootstelling en / of mechanische factoren zoals slijm belasting.

Ex vivo methode voor High Resolution Imaging van Cilia Motility in Knaagdieren luchtwegepithelen

Cilia van olfactorische sensorische neuronen bevatten eiwitten van de signaaltransductiecascade, maar een gedetailleerde ruimtelijke analyse van hun verdeling is moeilijk in cryosecties. We beschrijven hier een geoptimaliseerde aanpak voor hele montage-etikettering en en face visualisatie van ciliaire eiwitten.

Hele Mount Labeling van Cilia in het Main Olfactorische Systeem van Muizen

Primaire cilia beïnvloeden verschillende signaalroutes. De cochlea van zoogdieren is ideaal voor het onderzoeken van planaire celpolariteit (PCP) signalering. Cilia-disfunctie beïnvloedt cochleaire uitgroei, cellulaire patterning en oriëntatie van haarcellen, uitlezingen van PCP. Ons doel is om PCP-signalering in muis cochlea te analyseren via fenotypische analyse, immunohistologie en rasterelektronenmicroscopie.

Evaluatie van Planar-Cell-Polariteit Phenotypes in ciliopathie Mouse Mutant Cochlea

Dit manuscript presenteert methoden voor het analyseren van Morfometrische en cellulaire veranderingen binnen de mandibulaire condyle van knaagdieren.

Een Morfometrische en cellulaire analysemethode voor de lymfkliertest mandibulaire Condyle

Onlangs we toegewezen de driedimensionale (3D) ruimtelijke locaties van transportroutes voor verschillende eiwitten translocating binnen de primaire cilia in levende cellen. Hier leven de details van dit papier de experimentele opzet, het proces van biologische monsters en de data-analyses voor de 3D super resolutie fluorescentie imaging aanpak nieuw toegepast in primaire cilia.

Toepassing van snelle super resolutie snelheid microscopie in levende primaire Cilium

Primaire trilharen zijn extracellulaire structuren geassocieerd met de centriole. Primaire trilharendetectie door immunofluorescente kleuring is een relatief eenvoudige procedure die resulteert in beelden van zeer hoge kwaliteit. In dit protocol werden fibroblasten die primaire trilharen uitdrukken, vastgehouden, en afgebeeld in een fluorescerende of confocale microscoop.

Eenvoudige detectie van primaire trilharen door immunofluorescentie

Dit protocol beschrijft de detectie van CCL5-gemedieerde periostale skeletstamcelmigratie in realtime met behulp van levende intravitale microscopie van dieren.

Real-time beeldvorming van CCL5-geïnduceerde migratie van periosteale skeletstamcellen bij muizen

Het gebruik van kunstmatige intelligentie (Ai) om beelden te analyseren is in opkomst als een krachtige, minder bevooroordeelde en snelle aanpak in vergelijking met veelgebruikte methoden. Hier hebben we Ai getraind om een cellulair organel, primaire trilharen te herkennen en eigenschappen zoals lengte en kleurintensiteit op een rigoureuze en reproduceerbare manier te analyseren.

Kunstmatige intelligentie benaderingen voor het beoordelen van primaire trilharen

We presenteren gedetailleerde protocollen voor de generatie en karakterisering van 2D en 3D human induced pluripotent stamcel (hIPSC)-gebaseerde modellen van neocorticale ontwikkeling, evenals complementaire methodologieën die kwalitatieve en kwantitatieve analyse van primaire cilium (PC) biogenese en functie mogelijk maken.

2D en 3D humane geïnduceerde pluripotente stamcelgebaseerde modellen om primaire ciliumbetrokkenheid tijdens neocorticale ontwikkeling te ontleden

De huidige protocollen beschrijven nieuwe beeldvorming van de hele montering voor de visualisatie van perifere structuren in de oculaire lens met methoden voor beeldkwantificering. Deze protocollen kunnen in onderzoeken worden gebruikt om de relatie tussen lensstructuren op microschaal en de ontwikkeling/functie van lenzen beter te begrijpen.

Beeldvorming van de hele montage om de perifere lensstructuur, celmorfologie en organisatie te visualiseren en te kwantificeren

Hier beschrijven we in detail een methode, die is gebaseerd op microcomputertomografie, om 3D-modellen van craniomaxillofaciale botten bij muizen te segmenteren en te meten, voor een betere beoordeling van de craniomaxillofaciale botontwikkeling bij muizen dan wat mogelijk is met de huidige methoden.

Analyse van craniomaxillofaciale misvormingen bij muizen met behulp van driedimensionale microcomputertomografie

Leer volumetrische beeldvorming van primaire trilharen in het ARL13B-CENTRIN-2-muismodel voor ontwikkelingsbiologie. Deze methode maakt 3D-analyse van trilhaarorganisatie in groeischijfweefsel mogelijk.

Volumetrische beeldvorming en analyse van primaire trilharen in musculoskeletaal weefsel met behulp van het ARL13B-CENTRIN-2-muismodel (Video) | JoVE Journal

Volumetrische beeldvorming en analyse van primaire trilharen in musculoskeletaal weefsel met behulp van het ARL13B-CENTRIN-2-muismodel

Meer video's verkennen