Het craniale Neurale Protocol van de Lijstcellen Driedimensionaal in vitro Differentiatie voor Gemultiplexte Analyse

We zijn geïnteresseerd in hoe bepaalde beslissingen tijdens de ontwikkeling worden gereguleerd. Organoïdemodellen en single-cellomics-technologieën stellen ons in staat om vragen te stellen die voorheen niet mogelijk waren. Het gebruik van in vitro organoïdemodellen stelt ons in staat om grotere hoeveelheden gegevens te genereren, vooral voor voorbijgaande celpopulaties, zoals de neurale lijst.

De resultaten van het significante variabiliteitsmodel blijven een grote experimentele uitdaging. We hebben aangetoond dat schedellijstcellen prepotentiegenen opnieuw tot expressie brengen om het differentiatiepotentieel uit te breiden. Bereid om te beginnen een verse collagenase-oplossing met een concentratie van twee milligram per milliliter in het DMEM-knock-outmedium.

Zuig het ESC-medium op uit de putplaat dat 70 tot 80% confluent mESC bevat. Voeg nu voorzichtig een milliliter PBS toe aan de zijkant van de put. Schud de plaat om een gelijkmatige wasbeurt te garanderen.

Pipetteer de PBS eruit en vervang deze door twee milliliter collagenaseoplossing. Incubeer 30 tot 45 minuten bij 37 graden Celsius. Controleer de plaat onder een lichtmicroscoop met een vergroting van 10x na 20 minuten incubatie en vervolgens elke vijf minuten.

Wanneer de kolonies opgerolde randen vertonen, tik je krachtig op de plaatzijde om de kolonies los te maken. Verzamel met behulp van een serologische pipet van vijf milliliter de losgemaakte kolonies en breng ze over in een conische buis van 15 milliliter. Centrifugeer de kolonies bij 16 G gedurende drie minuten bij kamertemperatuur.

Zuig zoveel mogelijk medium uit de conische buis zonder de kolonies op de bodem te verstoren. Voeg vervolgens een milliliter 0,05% trypsine-oplossing toe aan de pellet en incubeer. Met een P1000 en P200 micropipet pipetteer de suspensie krachtig op en neer om de kolonies te dissociëren en voeg vervolgens twee milliliter mESC-kweekmedium toe om de trypsine te blokkeren.

Centrifugeer de buis gedurende drie minuten bij kamertemperatuur bij 160 G. Pipetteer het supernatant eruit en voeg vervolgens een milliliter CNCC-differentiatiemedium toe. Tel de cellen met een geautomatiseerd celtelapparaat of onder een microscoop en verdun de cellen vervolgens in een CNCC-differentiatiemedium om een concentratie van 3.000 levende cellen per 50 microliter te bereiken.

Zaai met een P200-micropipet 50 microliter van de celsuspensie in elk putje van een niet-TC-behandelde U-bodem plaat met 96 putjes. Vul elk putje bij tot 200 microliter met CNCC-differentiatiemedium en incubeer. Observeer de plaat met 24 uur durende cultuur van gedifferentieerde cellen onder een lichtmicroscoop om er zeker van te zijn dat kleine clusters met duidelijke randen zichtbaar zijn op de bodem van elk putje.

Plaats de plaat een nacht terug in de broedmachine. Verwijder op dag twee langzaam 100 microliter medium uit elk putje. Gebruik vervolgens een P200-micropipet waarvan de punt drie tot vier millimeter van het uiteinde is afgesneden om de neurosferen samen met het resterende medium op te zuigen.

Breng de neurosferen en het resterende medium over in een niet-TC behandelde plaat met 96 putjes met platte bodem. Controleer de overdracht onder een lichtmicroscoop. Bedek elk putje tot 200 microliter voorverwarmd CNCC-differentiatiemedium.

Zuig op dag vier 100 microliter medium op uit elk putje. Vervang het door 100 microliter voorverwarmd CNCC-differentiatiemedium en incubeer opnieuw. Controleer op dag vijf en zes de bevestiging van de neurosferen onder een lichtmicroscoop.

Zorg ervoor dat lichtere cellen die uit de neurosferen delamineren, het hoofdlichaam gaan omringen. Bereid het CNCC-onderhoudsmedium voor volgens de gegeven samenstelling. Filtreer runderserumalbumine door een filter van 0,22 micrometer voordat u het aan het medium toevoegt.

Zodra de groeifactoren zijn toegevoegd, bewaart u het medium maximaal drie weken bij vier graden Celsius en zorgt u ervoor dat het wordt beschermd tegen licht. Voeg 100 microliter fibronectine-oplossing toe aan elk putje van een niet-TC behandelde plaat met 96 putjes. Terwijl de plaat rust, zuigt u zoveel mogelijk CNCC-differentiatiemedium op uit de putjes van de niet-TC behandelde plaat met 96 putjes met platte bodem.

Vervang het medium door 50 microliter Accutase. Incubeer gedurende vijf minuten bij 37 graden Celsius. Voeg vervolgens 100 microliter CNCC-onderhoudsmedium toe aan elk putje om de Accutase te blussen.

Verwijder fibronectine uit de beklede putjes van de ontvangstplaat. filtreer vervolgens de losgeraakte post-migratie CNCC door een filter van 40 micrometer in de putjes van de ontvangende plaat. Gebruik op het gewenste tijdstip een P200-micropipet met afgesneden punt om neurosferen van de plaat met 96 putjes over te brengen in een buis van twee milliliter met een lage DNA-binding.

Nadat u de neurosferen drie minuten bij kamertemperatuur in de buis hebt laten bezinken, pipeteert u zoveel mogelijk medium en spoelt u vervolgens af met een milliliter koude PBS. Om de montagekamers voor te bereiden, plaatst u drie lagen dubbelzijdige transparante vezelloze tape op een microscoopglaasje. Knip met een scheermes een venster van drie bij acht millimeter in de dubbelzijdige tape.

Onder een stereoscoop, met een P200-snijpunt, pipetteer voorzichtig de neurosferen in het klaringsmiddel in de montagekamer. Gebruik vergrotingen tussen 2x en 4x om een gezichtsveld van de hele kamer te bieden en de neurosferen te identificeren. Plaats een dekglaasje op het oppervlak van de kamer en druk lichtjes op de zijkanten om het te hechten.

Neurosfeerculturen in niet-weefselplaten vertoonden uniforme aanhechtingen vanaf dag vijf, terwijl petrischaalculturen variabele aanhechting en versmelting van neurosferen vertoonden, vooral duidelijk op dag vier. De variabiliteit van de grootte van neurosferen was significant verminderd in plaatculturen met 96 putjes in vergelijking met petrischaalculturen op dag vier en zeven. De diameter van neurosferen in platen met 96 putjes varieerde van 139 micrometer tot 295 micrometer op dag vier en 383 micrometer tot 552 micrometer op dag zeven, terwijl petrischaalculturen een groter bereik vertoonden.

De groei van de neurosfeer was exponentieel in termen van celaantallen, van een gemiddelde van 1.082 cellen op dag twee tot 48.352 cellen op dag negen. De groei van de diameter was lineair en nam toe van een gemiddelde van 136 micrometer op dag twee tot 570 micrometer op dag negen. Immunofluorescentieanalyse bevestigde dat neurosferen en delaminerende cellen CNCC-markers AP2 alfa en SOX9 en EMT-marker TWIST1 tot expressie brengen op dag negen en 13.

PAX7 was alleen aanwezig in de neurosferen.