Bepaling van vier componenten in een RNA-afgiftesysteem voor lipidennanodeeltjes door middel van vloeistofchromatografie in combinatie met verdampingslichtverstrooiingsdetector

Ons onderzoek richt zich op de toepassing van chromatografie massaspectrometrie op het gebied van nucleïnezuur, peptide-eiwit en CDT. De uitdaging van dit experiment ligt in de scheiding van meerdere componenten van LNP's en het bepalen van componenten met significant verschillende concentraties en restproblemen. Het voordeel van dit protocol is dat het een goede scheiding, een breed lineair bereik en een stroombepaling van LNP's bereikt tegen lage kosten.

Zet om te beginnen een hoogwaardig vloeistofchromatografie- of HPLC-systeem op, in combinatie met een verdampingslichtverstrooiingsdetector. Installeer de chromatografische kolom in de richting van de pijl op de kolom. Sluit het ene uiteinde aan op de uitlaat van de autosampler en het andere op de inlaat van de verdampingslichtverstrooiingsdetector.

Om fase A voor te bereiden, meet en breng u nauwkeurig 1.387 microliter triethylamine over en lost u deze op in 1000 milliliter water. Meng goed en pas de pH aan op zeven met behulp van azijnzuur. Los voor de bereiding van fase B 1.387 microliter triethylamine op in 1000 milliliter methanol.

Meng grondig en pas de pH aan op zeven met azijnzuur. Plaats fase A en fase B in de bak. Start de LabSolutions-software en open het realtime analysevenster.

Klik op Bestand en selecteer Nieuw om een nieuw methodebestand te maken, wijzig de stoptijd van de vloeistofchromatografie in 15 minuten en klik op Toepassen op Alle acquisitietijd. Klik vervolgens op Pomp en wijzig de pompparameters. Selecteer de analysemodus als binaire hogedrukgradiënt, of BGE, en stel het debiet in op één milliliter per minuut.

Stel de initiële pomp B-concentratie in op 80%Wijzig de mobiele fasegradiënt op drie minuten naar 80%bij vier minuten naar 85%van 5.5 naar 12 minuten op 100%en laat de pomp na 12.1 minuten teruggaan naar 80%Klik nu op Kolom Oven en stel de oventemperatuur in op 55 graden Celsius. Klik vervolgens op ELSD om de temperatuur van de drijfbuis aan te passen naar 40 graden Celsius en sla de methode op. Klik op Downloaden en opstarten om het instrument te starten en in evenwicht te brengen.

Weeg nauwkeurig 10 milligram van elk van de vier standaardstoffen met lipide nanodeeltjes afzonderlijk. Los elk op in één milliliter methanol en vortex totdat het volledig is opgelost om voorraadoplossingen te verkrijgen met een concentratie van 10 milligram per milliliter voor elk bestanddeel. Breng met behulp van een pipet nauwkeurig 100 microliter van elke stockoplossing over in een monsterflesje.

Voeg 600 microliter methanol toe en meng grondig om een gemengde tussenoplossing te bereiden, een met een concentratie van 1000 microgram per milliliter. Breng nu nauwkeurig 20 microliter van elke voorraadoplossing over in een monsterflesje. Voeg 920 microliter methanol toe en meng grondig om een gemengde tussenoplossing te bereiden, twee met een concentratie van 200 microgram per milliliter.

Bereid een reeks standaardoplossingen in verschillende concentraties door middel van seriële verdunning. Breng vervolgens met behulp van een pipet nauwkeurig 100 microliter van het monster over in een monsterflesje. Voeg vervolgens 900 microliter methanol toe en meng goed om een tienvoudige verdunning van lipide nanodeeltjes en hun dissociatie van het nucleïnezuurmedicijn te garanderen.

Plaats de standaardoplossingen en monsteroplossingen in de autosampler van de vloeistofchromatograaf. Klik op realtime batch in de werkbalk van de assistent van het realtime analysevenster. Klik vervolgens op Nieuw in het menu Bestand om een nieuwe batchtabel te maken.

Voer in de batchtabel het nummer van de injectieflacon, de naam van de tray, het gegevensbestand en het injectievolume van de standaard- en monsteroplossingen in. Selecteer het opgeslagen methodebestand en klik op batchbestand opslaan in het menu Bestand. Wacht tot de vloeistofchromatograafdruk en de basislijn van het chromatogram stabiel zijn.

Klik vervolgens op real-time batch starten in de werkbalk van de assistent om de gegevensverzameling te starten. Open het browservenster van de LabSolutions-software voor gegevensanalyse. Sleep de standaardoplossingsgegevens naar de weergave met kwantitatieve resultaten om een kalibratiecurve vast te stellen.

Wijzig de parameters van de gegevensverwerking door in de methodeweergave op Bewerken te klikken. Wijzig in het venster met integratieparameters het integratiealgoritme in I-PeakFinder en stel het basislijntype in op Base to Base. Wijzig vervolgens in de identificatieparameters de identificatiemethode in band en stel de standaardbandbreedte in op 0,1 minuut.

Als u de kwantitatieve parameters wilt wijzigen, wijzigt u de kwantitatieve methode in een externe standaard. Stel het aantal kalibratieniveaus in op zeven. Selecteer vervolgens het type kalibratiecurve als exponentieel en wijzig de samengestelde instellingen.

Voer de namen en standaardoplossingsconcentraties van de vier componenten van de lipide nanodeeltjes in. Dubbelklik op de piektop om de retentietijden bij te werken. Klik op Weergeven om de wijziging van de gegevensverwerkingsparameters te voltooien.

Wijzig nu het steekproeftype in de weergave kwantitatieve resultaten in het standaard berekeningspunt. Stel de niveaus van de standaardoplossing in op één tot zeven, afhankelijk van de concentraties. Zodra de kalibratiecurven zijn vastgesteld, klikt u op Bestand in de menubalk en Sla het methodebestand op.

Sleep de voorbeeldgegevens naar de weergave kwantitatieve resultaten van het browservenster. Bekijk de weergegeven concentratieresultaten van de vier componenten van lipidennanodeeltjes in de monsters. De LNP-standaardoplossingsanalyse bereikte een basisscheiding met een scheidingsgraad van meer dan 1,5 voor de vier componenten, en er werden geen residuen waargenomen in standaardoplossingen met een hoge concentratie.

De kalibratiecurve voor de vier componenten vertoonde correlatiecoëfficiënten van meer dan 0,999 binnen het concentratiebereik van vijf tot 250 microgram per milliliter, wat wijst op een uitstekende lineariteit. De methode vertoonde een hoge reproduceerbaarheid, met een relatieve standaarddeviatie voor een retentietijd van minder dan 0,1% en een relatieve standaarddeviatie voor het piekgebied van minder dan 2% op basis van zes herhaalde injecties van 10 microgram per milliliter standaardoplossing. De analyse van werkelijke LNP-monsters die 10 keer waren verdund met methanol toonde componentconcentraties variërend van 150 microgram per milliliter tot 1.500 microgram per milliliter, waardoor een consistent hoge scheiding en gevoeligheid bij meerdere fabrikanten werd bereikt.