Visualisatie van methaan-cyclische microbiële dynamiek in wetlands aan de kust

Deze studie kwam visueel overeen met de ruimtelijke en temporele verdeling van belangrijke methaancyclische microbiële genen in de wetlands aan de kust van Zuid-Texas, en onderzoekt hoe omgevingsfactoren de methaandynamiek reguleren. Onze bevindingen laten zien dat de overvloed aan methaancyclusgenen in de wetlands aan de kust van Zuid-Texas gevoelig is voor omgevingsomstandigheden, waaronder zoutgehalte en seizoen. In het bijzonder mmoX, een type methaanmonooxygenase-gen, dat het meest voorkomt in koelere seizoenen.

Dit protocol richt zich op het onderzoek naar het detecteren van methaan-cyclische microbiële genen door nieuwe hulpmiddelen te bieden om ruimtelijke en seizoensgebonden microbiële dynamiek te visualiseren die wordt beïnvloed door omgevingsfactoren. Door geoptimaliseerde PCR-methoden te integreren met GIS-visualisatie, biedt dit protocol verbeterde detectie en ruimtelijke kartering van methaancyclusgenen, terwijl dynamische, ruimtelijke en seizoensgebonden microbiële patronen worden vastgelegd die worden beïnvloed door omgevingsfactoren.

[Verteller] Bereid om te beginnen een cPCR-reactiemengsel van 25 microliter voor met het eDNA en andere componenten. Plaats de buisjes in de PCR-machine en voer de cPCR-reactie uit met de juiste parameters. Bereid na cPCR het qPCR-reactiemengsel dat cybergroen bevat, met uitzondering van het sjabloon-DNA. Doseer 57 microliter van het bereide reactiemengsel in elk PCR-buisje. Voeg 3 microliter sjabloon-DNA, standaard of nucleasevrij water toe aan elke buis en tik voorzichtig op de buis om te mengen. Aliquot 20 microliter van het bereide reactiemengsel uit elke buis in de daarvoor bestemde putjes van een qPCR-plaat met 96 putjes. Sluit de PCR-plaat af met een zelfklevende PCR-afdichtingsfilm met behulp van een applicator. En centrifugeer het gedurende een minuut op 1.000 x g om een goede menging te garanderen en eventuele luchtbellen in de putjes te verwijderen. Plaats de PCR-plaat in de thermische cycler. Zet de qPCR-machine aan en open de bijbehorende software om het protocol in te stellen. Stel het qPCR-programma in en start de run. Open de software van het geografische informatiesysteem, ArcGIS Pro, en sla het projectbestand met de naam Study Area op in de opgegeven map op de computer. Klik op Kaart, selecteer vervolgens Basiskaart en kies terrein met labels als basiskaart. Klik op Zoeken en klik vervolgens op Zoeken. Wanneer de zoekbalk wordt geopend, typt u de naam van het studiegebied om het op de kaart te vinden. Als u het specifieke gebied wilt tekenen met behulp van georeferentie, klikt u op Weergave en vervolgens op Catalogusvenster van de bovenste laag. Dubbelklik op de map uit de catalogus en selecteer de gewenste bestandsnaam. Klik met de rechtermuisknop op het .gdb-bestand van de geodatabase. Klik op Nieuw en selecteer Functieklasse. Vervolgens verschijnt het venster Functieklasse maken. Typ het vak Naam en alias en klik onderaan op Voltooien. Klik nu op Bekijken, gevolgd door Inhoud. De naam van de alias wordt weergegeven in het deelvenster Inhoud. Klik op Bewerken in de bovenste laag, gevolgd door Maken. Het deelvenster Functies maken wordt geopend. Dubbelklik op de alias in het deelvenster Functies maken en de opties voor Feedback van hulpprogramma's configureren worden weergegeven. Selecteer lijnen en schets vervolgens lijnen op de kaart om de grens van het studiegebied te maken. Dubbelklik op de kaart om te voltooien. Minimaliseer de GIS-software en open een spreadsheet. Typ de voorbeeldnaam in de eerste kolom, de breedtegraad in de tweede kolom en de lengtegraad in de derde kolom. Gebruik de volgende vier kolommen voor qPCR-gegevens van pmoA1, pmoA2, mmoX en mcrA. Sla het bestand op in CSV-formaat in een specifieke map op de computer. Open vervolgens de GIS-software en klik op Gegevens toevoegen, gevolgd door XY Point Data. Selecteer het opgeslagen CSV-bestand in de map in het vak Invoertabel. Wijzig de naam van het bestand in het vak Output Feature Class en klik op Uitvoeren om de steekproefpunten op de kaart weer te geven. Klik nu op de zoekbalk bovenaan en zoek op Kriging. Selecteer het bestand van het bemonsteringsstation en kies pmoA1. Klik vervolgens op de omgeving, selecteer het bemonsteringsstation in laag en masker en klik op Uitvoeren. Om een lay-out van de kaart te maken, klikt u op Invoegen, Nieuwe lay-out en selecteert u ANSI-Landschap. Klik op Map Frame, selecteer de kaart met kriging en plaats alle kaarten in de lay-out door rechthoeken te tekenen. Selecteer Pijl Noord en plaats deze in de lay-out om de noordrichting aan te geven. Selecteer vervolgens Schaalbalk om de schaal van het gebied op de kaart weer te geven. Klik op Legenda en plaats deze vervolgens in de lay-out om kaartlegenda's weer te geven. Klik op Raster en selecteer vervolgens een zwarte graticule-optie om een raster met lengte- en breedtegraad te maken. Het raster verschijnt in het deelvenster Inhoud met het label Zwart horizontaal labelrooster. Dubbelklik op Black Horizontal Label Graticule, selecteer Componenten en verwijder de vinkjes 1 en het raster door op het kruisteken rechts ervan te klikken. Klik ten slotte op Delen in de bovenste laag en klik vervolgens op Lay-out exporteren. Selecteer het bestandstype als PDF, sla het bestand op de computer op met behulp van het vak Naam, stel de verticale resolutie in op 500 DPI en klik op Exporteren om het PDF-bestand van de kaart te maken. De cPCR-analyse onthulde ruimtelijke variabiliteit in de detectie van methaancycli-gerelateerde genen, waarbij mcrA-genen werden gedetecteerd in alle LB- en RV-monsters, maar afwezig waren in BC-monsters, waardoor het zoutgehalte werd gekoppeld aan de verdeling van methanogeen. De cPCR toonde helderdere banden voor pmoA1 met A189-mb661 primerparen, wat een lage maar detecteerbare abundantie in RV-monsters bevestigde, terwijl deze afwezig was in LB en BC. De qPCR-analyse toonde een hoge seizoensvariatie, waarbij mmoX-genen het meest voorkwamen tijdens het koele seizoen en pmoA1 het meest voorkwam tijdens het warme seizoen.