Beeldvorming van Ca2+ -signalen in kleine longaders bij fysiologische intraluminale druk
21 maart 2025
In dit protocol presenteren we een nieuwe techniek voor het registreren en analyseren van Ca2+ -signalen in intrapulmonale aders (kleine longaders of PV's) bij fysiologische intraluminale druk. De techniek omvat het isoleren van kleine PV's, het incuberen ervan met een Ca2+ -indicator, het canuleren en onder druk zetten, confocale beeldvorming van Ca2+ -signalen en gegevensanalyse.
Calciumsignalen reguleren de bloedvatfunctie en variëren in bron en rol. We streven ernaar hun specifieke functies in de vaatwand te begrijpen en afwijkingen te identificeren die verband houden met ziekte. De meeste onderzoeken naar longbloedvaten richten zich op slagaders of haarvaten, niet op longaders.
Er zijn geen studies die calciumsignalen in longaders hebben onderzocht onder normale intraluminale druk, ondanks hun fysiologische relevantie. Longaderen ondergaan drukveranderingen tijdens de cardiocycli, maar hun impact op calciumsignalen was niet bestudeerd. Ons protocol maakt het mogelijk om calciumsignalen in kleine longaders bij normale druk te verzamelen en automatisch te analyseren.
Ons protocol maakt toekomstige studies mogelijk over hoe intraluminale druk calciumsignalen in kleine longaders beïnvloedt, waardoor het begrip van hun regulatie en rol in gezondheid en ziekte wordt vergroot. Reinig om te beginnen de dissectiegereedschappen en de vaat in 100% ethanol en was ze vervolgens in gedeïoniseerd water. Met een schaar.
Open de borstholte van een geëuthanaseerde muis. Gebruik een tang om het hart en de longen voorzichtig uit de borstholte te verwijderen met minimale aanraking van de longen. Plaats vervolgens het weefsel op een met afdichtingsbescherming beklede plaat met koude HEPES-gebufferde fysiologische zoutoplossing.
Speld het hart en de longen vast met behulp van dissectiepennen, zodat de grote longaders en longslagaders duidelijk zichtbaar zijn en de linkerkwab van de long enigszins wordt uitgerekt. Gebruik de grote longaders als referentiepunten en verwijder voorzichtig het weefsel rond de kleine interpulmonale aders met behulp van een fijne schaar. Isoleer vervolgens voorzichtig de kleine longaders van het omliggende weefsel.
Bereid vervolgens een voorraadconcentratie van 2,5 millimolair Fluo-4 AM voor met DMSO. Bereid de laadoplossing voor met behulp van de voorraadoplossing. Plaats de kleine longaders in een buis van 1,5 milliliter met de laadoplossing.
Dek de buis af met aluminiumfolie, geïncubeerd in een waterbad bij 37 graden Celsius gedurende een uur. Om de kleine longaders te cannuleren, verwijdert u een ader uit de wasoplossing. Plaats het in een voorbereide drukmyografiekamer.
Met een tang met fijne punt kunt u voorzichtig het ene uiteinde van de kleine longader op een van de canules cannuleren en vervolgens een microfilament van nylondraad gebruiken om een knoop te leggen rond het gecanuleerde uiteinde van de kleine longader en de punt van de canule om deze vast te zetten. Duw de fysiologische zoutoplossing voorzichtig door de canule om het bloed in de longader te verwijderen. Gebruik nylondraad om het andere uiteinde af te binden met een glazen canule met behulp van microfilamenten.
Bevestig voor calciumbeeldvorming eerst een servodrukregelaar aan een slang met HEPES-gebufferde fysiologische zoutoplossing. Gebruik de controller om de kleine longader aan één kant onder druk te zetten. Sluit nu een peristaltische pomp aan op een inlaat en een uitlaat en een uitlaat en vernevel de oplossing.
Gebruik na de equilibratieperiode het 40x waterdompelobjectief en een confocaal beeldvormingssysteem met draaiende schijf om calciumbeelden te verkrijgen voor 1.000 frames. Om beeldanalyse uit te voeren, start u de op maat ontworpen Spark en software. Gebruik het filter van vijf bij vijf en het mediaanfilter om de afbeeldingen vloeiender te maken, gevolgd door een kader dat een plat gebied van de longader schetst met meerdere cellen voor automatische detectie van gebeurtenissen.
Klik op weergave en automatische detectie van gebeurtenissen. Stel de gebeurtenisdrempel in op een amplitude van 1.3F over F0, de tolerantie op 20%, het scanvak op zeven bij zeven pixels en het lopend gemiddelde op zeven afbeeldingen. Klik op Start Search of het oogpictogram.
Zoek de gebeurtenissentabel door te klikken op de tabel met kleine gebeurtenissen onder het weergavemenu en bereken vervolgens de gebeurtenissen per micrometervierkant door het aantal gedetecteerde calciumionsignalen te delen door de oppervlakte van het geselecteerde frame. Het aantal spontaan optredende calciumsignalen in kleine longaders bij vijf millimeter intraluminale druk van kwik was 0,73 plus of min 0,2 gebeurtenissen per minuut per vierkante micrometer onder basale omstandigheden. De toevoeging van ryanodine verminderde de calciumsignaleringsactiviteit drastisch.
Overzicht
Deze studie onderzoekt de specifieke functies van calcium (Ca2+)-signalen in kleine pulmonale venen (PV's) bij fysiologische intraluminale drukken, een gebied dat tot nu toe onontdekt bleef in het onderzoek naar bloedvaten in de longen. De auteurs presenteren een nieuw protocol voor het isoleren van kleine PV's, het toepassen van Ca2+-indicatoren en het uitvoeren van confocale beeldvorming om deze signalen te analyseren.
Belangrijkste componenten van de studie
Onderzoeksgebied
- Cardiovasculaire fysiologie
- Calciumsignalering
- Vasculaire biologie
Achtergrond
- Calciumsignalen zijn cruciaal voor de functie van bloedvaten.
- Het onderzoeken van longaders is essentieel, aangezien deze de pulmonale bloedstroom beïnvloeden.
- Er zijn nog geen eerdere studies gedaan naar Ca2+-signalen in longaders onder normale druk.
Gebruikte methoden
- Isolatie van kleine PV's uit muizenlongen
- Gebruik van Fluo-4 AM voor calcium-imaging
- Confocale microscopie voor signaaldetectie en analyse
Belangrijkste resultaten
- Vaststelling van een protocol voor het analyseren van Ca2+-signalering in kleine PV's.
- De gemeten basisfrequentie van de Ca2+-signalering bedroeg 0,73 ± 0,2 events per minuut per vierkante micrometer.
- Behandeling met ryanodine verminderde de Ca2+-signaleringsactiviteit significant.
Conclusies
- De studie vergroot het inzicht in hoe intraluminale druk de Ca2+-signalen in kleine PV's beïnvloedt.
- De bevindingen hebben implicaties voor het begrip van vasculaire regulatie bij gezondheid en ziekte.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Kwantitatieve beeldvorming van Ca2+-signalen in kleine longvenen bij fysiologische drukken vult een kritisch hiaat in de vasculaire biologie op en maakt mechanische risicoreductie mogelijk voor de validatie van pulmonale vasculaire targets. Deze mogelijkheid vergroot het voorspellende vertrouwen in de vroege ontdekkingsfase door directe, kwantitatieve read-outs te bieden van vasculaire signalering onder bijna-fysiologische omstandigheden. De methode ondersteunt portfoliobeslissingen door de functionele impact van kandidaat-interventies op vasculaire signaleringspaden die relevant zijn voor de ziekte te verduidelijken.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking en targetvalidatie
- Maakt directe analyse van Ca2+-gemedieerde signalering in ziekte-relevante vasculaire systemen mogelijk.
- Ondersteunt mechanische risicoreductie door de effecten van ryanodine-receptor-modulatie op de vasculaire functie te isoleren.
- Biedt kwantitatieve eindpunten voor functionele target-validatie in pulmonaal vasculair onderzoek.
Screening & Assayontwikkeling
- Stelt een reproduceerbare workflow vast voor het imageren en kwantificeren van Ca2+-signalen in intact vasculair weefsel.
- Faciliteert de standaardisatie van assays door gedefinieerde drukcondities en geautomatiseerde drempelwaarden voor eventdetectie.
- Maakt een betrouwbare vergelijking mogelijk van de effecten van verbindingen op de dynamiek van vasculaire Ca2+-signalering.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Rijgt experimentele condities uit met fysiologische druk om de translationele relevantie van de bevindingen te verbeteren.
- Ondersteunt de continuïteit van ontdekking naar preklinische validatie door het verschaffen van ziekterelateerde functionele readouts.
- Vermindert het translationele risico door vroege detectie van off-target effecten of adverse vasculaire effecten mogelijk te maken.
Integratie van Pipeline & Workflow
Dit beeldvormingsprotocol is geïntegreerd in het continuüm van ontdekking tot prekliniek door een platform te bieden voor hypothesetoetsing, doelwitvalidatie en kwantitatieve beoordeling van vasculaire signalering onder fysiologische omstandigheden.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothese-gestuurde analyse van Ca2+-signaleringspaden in longaders.
- Screening: Levert gestandaardiseerde, kwantitatieve resultaten voor vergelijkingen tussen verschillende condities en verbindingen.
- Analytics: Biedt geautomatiseerde eventdetectie en frequentiekwantificering voor een robuuste statistische analyse.
- Translationeel onderzoek: Slaat een brug tussen in vitro bevindingen en in vivo relevantie door fysiologische drukcondities te handhaven.
- Enterprise Reuse: Biedt een herbruikbaar imaging- en analyseplatform voor diverse vasculaire onderzoeksprogramma's.
Operationele en zakelijke impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit bij de validatie van vasculaire targets.
- Operationele waarde: Standaardiseert imaging- en analyseworkflows voor reproduceerbaarheid en schaalbaarheid.
- Strategische waarde: Informeert go/no-go-beslissingen door vroeg in de pijplijn kwantitatieve, fysiologisch relevante gegevens te verschaffen.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van vasculaire targets en kandidaat-interventies mogelijk.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in vasculaire dissectie, drukmyografie en confocale beeldvorming.
- Vereist toegang tot high-speed spinning disk confocale microscopie en geautomatiseerde analysesoftware.
- Noodzaak tot standaardisatie van drukinstellingen en drempelwaarden voor gebeurtenisdetectie tussen teams.
- Aanpassing voor verschillende vaatgroottes of soorten kan nodig zijn om translationele relevantie te waarborgen.
- Beperkt tot ex vivo analyse; in vivo validatie kan nodig zijn voor volledige translationele betrouwbaarheid.
