In vitro Trombosetest voor ventriculaire hulpmiddelen

We streven ernaar een praktisch en toegankelijk benchtop-protocol te ontwikkelen om potentiële trombogene hotspots in ventriculaire hulpmiddelen te identificeren, en zo de kritieke kloof tussen vroege prototyping en dierproeven te overbruggen. Dierproeven zijn nog steeds de primaire methode voor het evalueren van trombose in ventriculaire hulpmiddelen. Hoewel computationele vloeistofdynamica een hulpmiddel van onschatbare waarde is geworden voor ontwerpverificatie, kan het in vitro en in vivo validatie nog niet vervangen.

De complexe aard van de aanwezigheid van bloedstolling en tal van verstorende factoren, waardoor het moeilijk is om onderscheid te maken tussen werkelijke trombogeniciteit van het apparaat en experimentele artefacten. In vitro methoden voor het beoordelen van trombose bij VAD's worden nog steeds onderbenut en er bestaat tot op heden geen gestandaardiseerde methode. Door een uitgebreid protocol en videogids aan te bieden, hopen we een bredere acceptatie van benchtop-methoden mogelijk te maken.

Deze methode pakt zowel een technische als ethische uitdaging aan bij de ontwikkeling van medische hulpmiddelen, waardoor de afhankelijkheid van dierproeven wordt verminderd en het vermogen om tromboserisico's vroeg in het ontwikkelingsproces te detecteren, wordt verbeterd. Vul om te beginnen de testlus met 150 milliliter bloed. Verwijder alle lucht die in de lus zit.

Als u een axiale bloedpomp gebruikt, draait u deze in een verticale positie om lucht via drijfvermogen te laten ontsnappen. Als u een centrifugaalpomp gebruikt, draai deze dan ondersteboven en draai hem om ervoor te zorgen dat er geen lucht vastzit in secundaire stroompaden. Tik zachtjes op de slangen en de oppervlakken van het reservoir en knijp in eventuele luchtbellen om ze los te maken.

Inspecteer de horizontale delen van de slang en de verbindingen tussen de slang en de connectoren nauwkeurig om er zeker van te zijn dat er geen luchtbellen aanwezig zijn. Knijp in de intraveneuze zak om het vloeistofniveau dicht bij het smalle bovenste gedeelte te brengen. Klem vervolgens de zak met een hemostaat over de vloeistofleiding om de vloeistof-luchtinterface te elimineren en sluit de ontluchtingskraan.

Sluit vervolgens de kraan aan het einde van de drukleidingen. Verwijder de manometerslang en bevestig een spuit van drie milliliter. Open de kraan en zuig één tot twee milliliter vloeistof in de verlenglijn, ongeveer vier centimeter.

Sluit de kraan, maak de spuit los en sluit de manometerslang weer aan. Open de kraan om drukmetingen mogelijk te maken. Vul ten slotte de bemonsteringspoort met een spuit.

Knip of scheur vervolgens een pluisvrij doekje in drie gelijke stukken. Draai de hoek van een fragment om een punt te vormen en steek deze in de injectiepoort om achtergebleven bloed te absorberen. Draai het tweede fragment.

Bevochtig het met zoutoplossing en steek de natte punt in de poort om al het resterende bloed te verwijderen. Gebruik het derde fragment om eventuele resterende zoutoplossing in de poort op te nemen. Start nu het ventriculaire hulpapparaat, of VAD, op een lage snelheid en laat het ongeveer vijf seconden draaien om eventuele ingesloten luchtbellen in de pomp los te maken.

Stop de pomp. Als er luchtbellen in de zak verschijnen, herhaal dan het ontluchten. Start de pomp opnieuw op een lage snelheid om het bloed in de lus te laten circuleren.

Breng een milliliter heparinesnatrium, twee milliliter van de bereide calciumchloride-oplossing en 1,5 milliliter EDTA over in afzonderlijke buisjes. Om heparine in de lus aan het bloed toe te voegen, aspireert u 75 eenheden heparine op in een micropipet en doseert u deze in een spuit van drie milliliter door tegelijkertijd de pipet af te geven en de zuiger van de spuit op te zuigen zonder te morsen. Gebruik de dwarse poort van de driewegkraan om stoffen met een spuit in de lus toe te dienen.

Draai de mannelijke kunstaasvergrendeling op de kraan zodat de injectiepoort naar boven wijst om luchtbellen aan de bovenkant op te vangen. Bevestig nu de spuit aan de injectiepoort via de lokvergrendeling met de poort naar boven en de spuit verticaal naar beneden. Trek de zuiger van de spuit aan om deze met bloed te vullen en meng de heparine met het bloed terwijl u eventuele lucht in de spuit opzuigt.

Laat de luchtbellen naar de bovenkant van de spuit stijgen. Injecteer het mengsel vervolgens in de lus en zorg ervoor dat er geen lucht binnendringt. Breng het bloed vier tot vijf keer in en uit de spuit om ervoor te zorgen dat het gehepariniseerde bloed niet beperkt blijft tot de ruimte in de haven.

Om de geactiveerde stollingstijd, of ACT, van bloed in de lus te titreren, voegt u eerst 750 microliter calciumchloride-oplossing met één mol toe aan 150 milliliter bloed in de lus. Om bloedstolling te voorkomen, injecteert u de vloeistof snel na het verwijderen van restlucht. U kunt ook het calciumchloride in de spuit verdunnen met één milliliter tris-gebufferde zoutoplossing om voortijdige stolling te verminderen.

Nadat u het geïnjecteerde calciumchloride ten minste twee minuten hebt laten circuleren, bevestigt u een spuit van één milliliter aan de bemonsteringspoort. Zuig 0,5 milliliter afvalwater op en gooi ze weg om stilstaand bloed uit de haven te verwijderen. Sluit vervolgens een nieuwe spuit van één milliliter aan op de bemonsteringspoort en neem 0,5 milliliter bloed af voor analyse.

Meet de geactiveerde stollingstijd met behulp van een point-of-care volbloedstollingssysteem. Reinig de bemonsteringspoort met pluisvrije doekjes, zoals eerder gedemonstreerd. Raadpleeg de titratiewaarden om de beoogde calciumchlorideconcentratie te bepalen.

Verhoog de calciumconcentratie stapsgewijs om een geactiveerde stollingstijd van 300 seconden te bereiken. Begin met de in-vitrotrombosetest zodra de ACT van 300 seconden in de lus is bereikt. Stel de pomp in op het gewenste debiet en de gewenste druk door de rotorsnelheid aan te passen en de weerstand te regelen met behulp van de Hoffman clamp.

Meet de ACT elke 15 minuten door een bloedmonster uit de lus te halen en een druppel bloed in het ACT-instrument te plaatsen, zoals eerder gedemonstreerd. Als de ACT onder de 200 seconden daalt, injecteer dan nog eens 25 eenheden heparine-natrium in de lus. Injecteer na een uur 1,5 milliliter 0,5 molaire EDTA in de lus om verdere stolling te remmen.

Laat de EDTA twee minuten circuleren en mengen en stop dan de pomp. Klem met behulp van hemostaten de slang vast die is aangesloten op de inlaat en uitlaat van de pomp en plaats de klemmen op drie tot vier centimeter afstand van de inlaat- en uitlaatweerhaken. Koppel de slang voorzichtig los om de pomp te ontgrendelen.

Tap vervolgens het bloed uit de pomp en de stroomlus af in een container. Pipetteer ten slotte de zoutoplossing door de inlaat en uitlaat van de pomp om eventueel achtergebleven bloed te spoelen. Afzetting van bloedplaatjes werd consequent waargenomen langs de wortels van de bladen in de prototypes van de pompen.

Door de titanium componenten elektrolytisch te polijsten, werd de trombusvorming op deze gebieden geëlimineerd. Het prototype had ook een onvolmaakte coöptatie in de overgang van de voor- en achterbehuizing, wat resulteerde in een spleet waar bloed naar binnen sijpelde en stolde. Door te leppen en te polijsten werd de passing van de componenten verbeterd en werd de trombusvorming verminderd.

Procedurefouten en onvolledige ontluchting van de lus kunnen artefacten introduceren. In dit geval veroorzaakte een experimentele fout tijdens de injectie van calciumchloride plaatselijke coagulatie en de resulterende trombus kwam de centrifugale Maglev-pomp binnen, waardoor het stroompad werd afgesloten. Bolvormige, losjes aangehechte stolsels die op oppervlakken worden waargenomen, zijn vaak het gevolg van luchtbellen die zijn ingekapseld in stolsels.

Vreemd materiaal en puin dat in de lus circuleerde, werden ook ingekapseld in trombi en gehecht aan pompoppervlakken. Ringtrombi bij de knooppunten van de slangconnector waren een indicatie van een optimaal ACT-bereik tijdens de test.