Fluorescentietesten voor de studie van Mycobacterium tuberculosis Interactie met de immuunreceptor SLAMF1

Ons onderzoek biedt een nuttige gids voor het bestuderen van de biochemische interactie tussen microbacterie tuberculose en microbiële sensoren die menselijke microfagen tot expressie brengen en zal relevant zijn voor de stijvere moleculen die een rol spelen bij het binnendringen van microbacterie tuberculosis in fibrocyten. Receptorinteractie is in de loop der jaren bestudeerd met behulp van benaderingen die meestal gebruik maken van reportermachines, hermetische moleculen, genivelleerde recombinante eiwitten, knock-out, knockdown, modellen met lagere expressie. Deze technieken kunnen uitdagend, tijdrovend en soms duur zijn.

Aan de hand van het gepubliceerde protocol tonen we voor het eerst aan dat de SLMF1-receptor in macrofagen interageert met mycobacterium tuberculosis, waardoor de opname van bacteriën wordt bevorderd en de endolysosomale rijping wordt bevorderd. We hebben de moeilijkheden overwonnen die verband houden met experimenten met genexpressie en we hebben een nieuw doelwit voor nieuwe therapeutische strategieën beschreven. Ons protocol biedt twee alternatieven om biochemische interactie tussen microbacterie tuberculose en SLMF1 microbiële sensor te detecteren met behulp van flowcytometrie en fluorescentiemicroscopie, twee meestal beschikbare en vruchtbaar gebruikte technieken.

Deze methodologie heeft veel potentiële toepassingen en kan gemakkelijk worden aangepast in andere onderzoekscontexten. We bieden een eenvoudig protocol dat de interactie van de mycobacterium tuberculosis-receptor evalueert met behulp van geïnactiveerde en gesonificeerde bacteriën van de hele cel, die kan worden uitgevoerd onder BSL2-conditie, maar gemakkelijk kan worden aangepast aan andere receptoren en levende stammen. Indien nodig kunnen deze testen ook worden uitgevoerd onder BSL3-omstandigheden met verschillende levende pathogenen.

Breng om te beginnen het bloed van gezonde donoren voorzichtig over in buisjes van 50 milliliter en verdun het tot de helft van het volume met zoutoplossing. Bereid een dichtheidsgradiëntmedium voor en centrifugeer het monster om perifere mononucleaire bloedcellen, PBMC's, te scheiden. Verzamel de PBMC's uit de witachtige halo.

Nadat u de cellen in een celtelkamer hebt geteld, voert u magnetische selectie uit met CD14-kralen om de CD14-positieve monocyten te verzamelen. Resuspendeer vervolgens de geïsoleerde cellen in het RPMI 1640-medium. Zaai 500 microliter CD14-positieve monocyten in een concentratie van één keer 10 tot de macht van zes cellen per milliliter in elk putje van een celkweekplaat met 24 putjes in serumafwezigheid om de hechting te bevorderen.

Was de putjes na twee uur met voorverwarmd RPMI 1640 medium om niet-aanhangende cellen te verwijderen. Differentieer de monocyten in macrofagen met behulp van één milliliter volledig RPMI 1640-medium gedurende 16 tot 18 uur. Was de volgende dag de putjes met een milliliter PBS en voeg een milliliter complete RPMI 1640-media toe aan elk putje.

Stimuleer de macrofagen met 10 microliter gesonificeerde mycobacterium tuberculosis-antigenen gedurende 24 uur. Gooi de volgende dag met een P-1000-pipet het volledige RPMI-medium uit de putjes van de plaat. Voeg koude PBS toe en pipetteer op en neer om de macrofagen te oogsten.

Breng de cellen over naar microcentrifugebuisjes van 1,5 milliliter. Centrifugeer de buisjes vijf minuten bij 500G bij vier graden Celsius. Gooi het bovenstaande weg en suspendeer de pellet opnieuw in een gesupplementeerde radio-immunoprecipitatietestbuffer.

Incubeer de suspensie gedurende een uur op ijs en vortex elke 10 minuten. Centrifugeer de suspensie bij 14.000 G gedurende 15 minuten en vang het bovenstaande op. Incubeer één keer 10 tot de macht van zes hele geïnactiveerde mycobacterium tuberculosis-cellen met 50 microliter eiwitextract van één keer 10 tot de kracht van zes macrofagen 's nachts bij vier graden Celsius in een roterende microbuishouder.

Om het eiwitbacteriecomplex te kleuren, voegt u de volgende dag het anti-menselijke SLAMF1-antilichaam toe aan de microbuis, vortex het mengsel en broedt u een nacht gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius in het donker. Na het wassen van de eiwitbacteriecomplexen met FACS, suspendeert u ze opnieuw in FACS-buffer en verkrijgt u het monster op een flowcytometer. Gebruik een chirurgisch pincet met ronde neus om 12 millimeter ronde deksels in de putjes van een kweekplaat met 24 putjes te plaatsen.

Incubeer het dekglaasje met mycobacterium tuberculosis rhodamine antigenen gedurende een uur bij 37 graden Celsius. Voeg na incubatie 100 microliter eiwitextract verdund in 300 microliter PBS toe en incubeer gedurende twee uur bij kamertemperatuur met agitatie. Wikkel het deksel van de kweekplaat in met paraffinefolie.

Voeg een druppel van 60 microliter eerder getitreerd anti SLAMF1 primair antilichaam toe aan het met paraffinefilm bedekte deksel. Verwijder voorzichtig het dekglaasje van de plaat met behulp van een chirurgisch pincet en naalden met gebogen fijne punt. Verwijder na incubatie met primaire en secundaire antilichaamoplossing overtollige vloeistof en monteer het dekglaasje op een druppel montagevloeistof die op een glasplaatje is geplaatst.

Plaats het objectglaasje onder een fluorescentiemicroscoop en observeer de cellen met behulp van geschikte filters. Monocyten werden met succes geïsoleerd uit PBMC's met een zuiverheid van 95% of meer, en van monocyten afgeleide macrofagen werden gegenereerd na therapietrouw en nachtelijke cultuur. SLAMF1-oppervlakte-expressie werd geïnduceerd in macrofagen die werden gestimuleerd met mycobacterium tuberculosis-antigenen, en de niveaus werden bevestigd met behulp van flowcytometrie.

De interactie tussen SLAMF1 en mycobacterium tuberculosis hele cellen werd aangetoond met behulp van een verknopingstest gevolgd door flowcytometrie. De interactie tussen de SLAMF1- en Mycobacterium tuberculosis-antigenen werd gevisualiseerd met behulp van fluorescentiemicroscopie, waarbij co-lokalisatie werd bevestigd door samengevoegde beelden.