Zuivering van het sarco-endoplasmatisch reticulum ca²⁺-ATPase uit de spier van konijnen

Ons onderzoek richt zich op het zuiveren van SERCA, met een hoge structurele kwaliteit en katalytische activiteit, terwijl we onderzoeken of trehalose SERCA stabiliseert tijdens de zuivering, waardoor de stabiliteit en functionaliteit worden verbeterd. De bepaling van de driedimensionale structuur van P-type ATPases in hun oligomere toestanden. Het gebruik van kunstmatige intelligentie voor structurele modellering van ATPases, simulaties van structurele dynamica en moleculaire docking van liganden om ziektetherapieën te verkennen en de analyse van eiwitfuncties en nieuwere technologieën te verbeteren. Huidige uitdagingen zijn onder meer het begrijpen van energieconversiemechanismen in P-ATPases, het ophelderen van hoe de quaternaire structuur functie en activiteit reguleert, en het identificeren van effectieve remmers voor therapeutische toepassing bij ziekten bij de mens. We bevestigen de hexamere toestand van GS-plasmamembraanproton-ATPase en tonen de structurele dynamica, afhankelijkheid of mediumviscositeit aan, zoals beschreven door de theorie van Kramers.

[Verteller] Verkrijg om te beginnen een snelle spiertrekking van wildtype Oryctolagus cuniculus. Suspendeer het in drie delen van 100 millimolair kaliumchloride voor maceratie. Mix gedurende een minuut, gevolgd door een minuut ijskoude rust. Centrifugeer het monster gedurende 5 minuten bij 1.500 g bij 4 graden Celsius om de weefselresten te verwijderen. Verzamel het bovenstaande in een buis en homogeniseer het vervolgens met een tissueslijper. Centrifugeer vervolgens het homogenaat, gevolgd door het supernatant. Suspendeer de pellets in ongeveer 40 milliliter 0,5 molaire sucrose. centrifugeer nu de suspensie bij 12.000 g bij 4 graden Celsius gedurende 15 minuten. Verdun het resulterende supernatans in 0,6 molair kaliumchloride en 0,15 molair sucrose voordat u gaat centrifugeren. Suspendeer de pellet met sarcoplasmatisch reticulumblaasjes in een buffer met 0,3 molaire sucrose, 0,1 molaire kaliumchloride en 5 millimolair tris-hydrochloride bij pH 7,0. Aliquot de sarcoplasmatische reticulumblaasjes in volumes van 1 milliliter. Incubeer de sarcoplasmatische reticulum vesuspensie op ijs gedurende 10 minuten met zachte agitatie en centrifugeer vervolgens. Suspendeer de pellet in minder dan 3 milliliter 25 millimolaire Tris-hydrochloridebuffer. Na het homogeniseren van de suspensie, stelt u deze in op een eindvolume van 10 milliliter met Tris-hydrochloridebuffer. Bepaal de eiwitconcentratie met behulp van de Lowry-test. Voeg azolectine toe in 5 milligram per milliliter en voeg vervolgens 0,85 Zwittergent 3-14 toe. Homogeniseer de suspensie opnieuw en centrifugeer gedurende 60 minuten bij 100.000 g bij 4 graden Celsius. Verzamel het bovenstaande in een nieuw buisje. Verdun het in een verhouding van 1 tot 2 met 2 millimolaire EGTA bij pH 7,2. Giet de suspensie voorzichtig op een onderbroken trehalose-concentratiegradiënt in de Tris-buffer. Centrifugeer vervolgens zoals eerder en vang de transparante, lichtgele korrel op. Suspendeer de pellet voorzichtig in een kleine hoeveelheid Tris-buffer. Meet de eiwitconcentratie en verdun deze vervolgens om de eiwitconcentratie aan te passen tot 2 milligram per milliliter. Bereid voor de ATPase-activiteit 1 milliliter van het reactiemengsel. Vortex de reactietest om te homogeniseren en incubeer deze vervolgens gedurende 10 minuten bij 37 graden Celsius. Voeg 0,9 eenheden L-lactaatdehydrogenase en 1,5 eenheden pyruvaatkinase toe. Voeg 10 microgram SERCA toe om de ATPase-reactie op gang te brengen. Bewaak de absorptieverandering elke seconde gedurende 600 seconden bij 340 nanometer met een spectrofotometer met een thermostatische celhouder om de vorming van NAD te bepalen. Voor de etiketteringstest van SERCA met fluoresceïne-isothiocyanaat of FITC, suspendeert u eerst 20 microgram SERCA in 50 microliter etiketteerbuffer. Vortex om goed te mengen. Incubeer de monsters vervolgens in het donker bij kamertemperatuur gedurende 15, 10, 7, 5 en 2 minuten. Om de etiketteringsreactie te stoppen, voegt u een gelijk volume ijskoude stopbuffer toe. Incubeer 5 minuten op ijs in het donker. Onderwerp de FIRCA-gelabelde SERCA aan SDS-PAGE. Stel de heldere gels bloot aan ultraviolet licht met een golflengte van 302 nanometer en fotodocumenteer het resultaat. Kleur tot slot de gel met Coomassie blauw. Fotodocumenteer het resultaat. Voor circulaire dichroïsmespectra-analyse suspendeert u SERCA eerst in 400 microliter 10 millimolaire fosfaatbuffer met een pH van 7,0 bij 25 graden Celsius. Laad het monster in een cel met een padlengte van 0,1 centimeter. Stel nu het verre ultraviolette spectrabereik in tussen 190 en 260 nanometer en de interne resolutie en bandbreedte op 1 nanometer. Neem het circulaire dichroïsmesignaal op met een snelheid van 50 nanometer per minuut bij 25 graden Celsius. De Coomassie blauw gekleurde SDS-PAGE-gel demonstreerde de verrijking van de SERCA-eiwitband naarmate de zuivering vorderde. De laatste SERCA-zuiveringsstap met behulp van ultracentrifugatie op een trehaloseconcentratiegradiënt resulteerde in een zuiverheid van meer dan 90%. Sarcoplasmatische reticulumblaasjes bevatten een hoge hoeveelheid SERCA, waarbij ongeveer 73% van het totale eiwit in de blaasjes overeenkomt met dit P-ATPase. Een Michaelis-Menten kinetisch patroon werd waargenomen voor de gezuiverde SERCA in de ATP-hydrolysesnelheid versus ATP-concentratiecurve, wat de enzymatische functionaliteit ervan bevestigt. De Lineweaver-Burk-plot onthulde een Michaelis-constante van ongeveer 10 micromol voor ATP, consistent met eerder gerapporteerde waarden. FITC-labeling van SERCA gaf een intacte nucleotidebindingsplaats aan. De Coomassie blauw gevlekte SERCA-band kwam precies overeen met de FIRCA-gelabelde band. Circulaire dichroïsmespectroscopie bevestigde de hoge structurele kwaliteit van de gezuiverde SERCA, waarbij het spectrum goed gedefinieerde secundaire structuurelementen aangeeft.