Extractie en weefselopruiming Voorbereiding van hersen-ruggenmergmonsters van muizen

Ons onderzoek richt zich op hoe het centrale zenuwstelsel de cognitieve functies bemiddelt en interageert met het immuunsysteem. We streven ernaar de methoden voor het onderzoeken van de hersenen en het ruggenmerg te verbeteren en de fundamentele vragen over deze interacties aan te pakken. Deze methoden houden de hele hersenen en het ruggenmerg intact, wat ons helpt de cel grondiger in kaart te brengen met behulp van weefselopruiming. Het maakt het proces ook sneller en nauwkeuriger, waardoor de tijd en de fouten worden verminderd in vergelijking met de traditionele sectie- en beeldvormingsmethoden.

We hebben de hersenen en de ruggenmerggebieden in kaart gebracht die verbonden zijn met de longen. Ons onderzoek zal zich richten op het onderzoeken van de neuro-immuuncommunicatie tussen de hersenen, het ruggenmerg en de longen. En hoe deze interactie de immuunrespons beïnvloedt.

[Docent] Bevestig om te beginnen de ledematen van de muis aan de brede acrylplaat met behulp van stalen klemmen. Knip met een schaar de huid tussen de twee dijbenen af en blijf naar boven knippen tot het middenrif is bereikt. Open beide zijden van de thorax door het middenrif en gebruik een schaar en een rechte tang om het hart bloot te leggen. Steek een infuusnaald van 0,7 millimeter die aan een perfusiebuis is bevestigd in de linkerventrikel en maak een incisie van één tot twee millimeter in het rechter atriumaanhangsel. Scheid na perfusie de huid op de rug en het hoofd van de muis met behulp van een oogheelkundige schaar. Snijd de wervelkolom door op het punt waar de lijn die de bovenste achterranden van beide ledematen verbindt, de wervelkolom kruist. Verwijder spier- en vetweefsel uit de nek en rug van de muis om de wervelkolom en schedel bloot te leggen. Knip met een veneuze schaar langs de middellijn tussen de linker- en rechterkant van de wervelkolom en het ruggenmerg vanaf het onderste uiteinde van het wervelkanaal. Verwijder vervolgens het bovenste gedeelte en de bilaterale zijden van de afgehakte wervelkolom om het ruggenmerg bloot te leggen. Herhaal de stappen totdat je de hersenverbinding bereikt. Plaats de punt van een blad van de veneuze schaar tussen het foramen magnum en de hersenen. Schuif en snijd langs de midsagittale hechting om de schedel te openen. Gebruik een tang om de schedel te verwijderen en de hersenen bloot te leggen. Verwijder nu met een tang en een veneuze schaar het ruggenmergweefsel van de muizenhersenen van het schedeluiteinde. Gebruik een ontleedtang om het ruggenmergmembraan onder de stereomicroscoop te verwijderen. Bevestig vervolgens met hechtingen het monster van het ruggenmerg van de hersenen aan de bevestigingsplaat. Voeg ten minste 20 keer het monstervolume van 4% paraformaldehyde toe. Gooi na fixatie het paraformaldehyde weg en was het monster drie keer met PBS. Fixeer om te beginnen het geëxtraheerde ruggenmerg van de muizenhersenen in paraformaldehyde. Meng voor de lipidenverwijderingsoplossing oplossing A en B in een massaverhouding van negen op één. Voeg 50 milliliter van de lipidenverwijderingsoplossing toe aan een centrifugebuis van 50 milliliter en plaats het gefixeerde weefsel erin. Vervang na incubatie in oplossing C de oplossing en plaats de kweekschaal met het monster volledig ondergedompeld in oplossing C op een lichtbak met een schaallijn. Om geloplossing te bereiden, voeg je 147 gram oplossing C en drie gram agarose toe aan een glazen fles van 200 milliliter. Meng de componenten goed met een roerstaaf en zet ze in de magnetron tot de agarose is opgelost. Breng de geloplossing over naar een laboratoriumoven die is ingesteld op 37 graden Celsius. Giet een twee millimeter diepe laag getemperde geloplossing van 37 graden Celsius in de vorm en laat deze 30 minuten afkoelen in een koelkast van vier graden Celsius tot hij halfvast is. Plaats het monster met de brekingsindex in de mal en voeg geloplossing toe tot het niveau of iets onder de bovenkant van het monster. Zet de vorm twee uur terug in de koelkast van vier graden Celsius. Dek af met een dekglaasje en zet opnieuw in de koelkast. Verwijder het dekglaasje met een pincet en haal het ingebedde monster eruit. Voeg 30 milliliter beeldvormingsoplossing toe aan een buisje van 50 milliliter en dompel het monster onder in de oplossing. Breng 502-lijm aan om het monster stevig op de monsterhouder te bevestigen, voordat u de houder op het beeldvormingsapparaat bevestigt. Start de scansoftware en selecteer het 4x vergrotingsniveau in het vergrotingsgedeelte. Klik op de kalibratieknop om de kalibratiemodus te activeren. Klik op de voorbeeldknop om de voorbeeldmodus te openen. Klik vervolgens op de knop voor de beweging in de Z-richting om het monster langzaam omhoog te bewegen vanaf de onderkant van de monsterkamer totdat de gegenereerde lichtplaat door het monster gaat. Selecteer het juiste laserkanaal en de optie voor de verlichtingsmodus. Selecteer de richting van het scanpad voor het voorbeeld. Klik op de knop voor automatisch scannen om te beginnen met het vastleggen van de afbeeldingen van het monster. Het protocol heeft met succes de hele hersenen en het ruggenmerg van de muis geconserveerd met behoud van intacte fluorescerende signalen voor heldere beeldvorming. De fluorescerende beeldvorming van het ruggenmergmonster van de hersenen visualiseerde duidelijk gedetailleerde neurale structuren. Beelden met een hogere vergroting zorgden voor een betere visualisatie van individuele fluorescerend gelabelde cellen.