Profilering van gepermethyleerde mucine O-glycanen met behulp van matrix-geassisteerde laserdesorptie/ionisatie Time-of-flight massaspectrometrie

We zijn de glycobiologie van de interacties tussen gastheer en microben in het maagdarmkanaal aan het bestuderen, met een focus op de rol van de slijmlaag die het maagdarmkanaal bedekt, en in het bijzonder, mucines en hun glycanen bij gezondheid en ziekte. Mucine-glycanen worden steeds meer erkend als belangrijke factoren in gastheer-microbe interacties omdat ze voedingsstoffen en bindingsplaatsen voor bacteriën bieden. Een verandering in het glycosyleringsprofiel kan leiden tot verstoring van de microbiotische samenstelling en vice versa, fenotypes die vaak worden waargenomen in ziektetoestanden.

Echter, mucines zijn berucht moeilijk te bestuderen omdat ze zwaar geglycosyleerd zijn. Innovaties in bemonsteringstechnieken en gevolganalyse in bioinformatica kunnen het veld vooruit helpen, evenals nieuwe benaderingen voor monsterverwerking om de doorvoer te verhogen en de tijd van monsterverzameling tot resultaten te verkorten. Andere analytische technieken laten een meer gedetailleerde structurele karakterisering van glycanen toe, maar vereisen lange uitvoerings- en analysetijd.

De hier beschreven techniek met behulp van MALDI-TOF massaspectrometrie heeft het voordeel van snelheid, wat het geschikt maakt voor screening en profilering. Om te beginnen, meng gezuiverde mucines met 250 microliters van de bèta-eliminatie buffer in een glazen vier milliliter vial. Sluit de fles stevig met een met polytetrafluorethyleen beklede dop en incubeer de reactie bij 45 graden Celsius gedurende 16 uur.

Op ijs, voeg een milliliter van de 5% azijnzuuroplossing druppelsgewijs toe aan de reactiemix. Voor het ontzouten van het monster, steek een glazen pipet met een kleine hoeveelheid glasswol. Voeg 1,5 milliliter van de harssuspensie vanaf de bovenkant toe aan de glazen pipet, laat het dan bezinken en uitlekken.

Was nu de hars met twee milliliter 5% azijnzuur en gooi de doorloop weg. Voeg vervolgens het mucine-monster toe aan de ontzoutingskolom en verzamel de doorloop in een vijf milliliter buis. Was de kolom twee keer met één milliliter 5% azijnzuur om de doorloop te verzamelen.

Gebruik vervolgens een centrifugale evaporator om het azijnzuur te verwijderen en het monster te concentreren bij vijf millibar en 30 graden Celsius gedurende twee uur. Los het monster op in 0,5 milliliter methanolische azijnzuur en droog het onder een stroom stikstof. Voeg met een glazen spuit vier milliliter DMSO toe aan de vial met een natriumhydroxide en methanol mengsel.

Na het mengen, centrifugeer de oplossing gedurende twee minuten bij 2.000 G. Giet voorzichtig het supernatant af en verwijder de zouten zonder de gel te verstoren. Nadat je er zeker van bent dat er geen zouten meer worden gevormd, suspendeer de gel in vier milliliter anhydrisch DMSO om de permethyleringsbasis suspensie voor te bereiden.

Vervolgens, voeg anhydrisch DMSO en permethyleringsbasis toe aan het gedroogde mucine-monster, onmiddellijk gevolgd door jodomethaan. Incubeer de permethyleringsreactie gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur met krachtig schudden. Voeg vervolgens 0,5 milliliter water toe om de reactie te beëindigen.

Nadat het monster troebel wordt, spoel het met stikstof tot het helder wordt. Laad het monster op een hydrofiel-lipofiel evenwicht 96-wel platextractieplaat. Breng positieve druk aan om de monsters met een stromingssnelheid van ongeveer één milliliter per minuut door de vaste fase te duwen.

Na het weggegooien van de doorloop, was de putjes twee keer met één milliliter water. Elueer de glycanen van de plaat twee keer met één milliliter methanol. Breng druk aan totdat methanol de plaat begint te verlaten, laat vervolgens de zwaartekracht de vereiste snelheid behouden.

Droog het monster met een centrifugale evaporator en los het op in 10 microliters TA50. Na het mengen van één microliter monster en de matrix, laad het op een stalen MALDI doelplaat en laat het drogen. Voor data-analyse, laad het geëxporteerde ASCII-bestand van het massaspectrum in GlycoWorkbench.

Na het uitvoeren van baseline correctie, bereken de piekcentroïden en selecteer in het pop-upvenster het juiste massabereik, minimale signaal-ruisverhouding en minimale massaspectrometrie piekintensiviteit. Gebruik vervolgens de Glyco-Peakfinder tool om de structuurcomposities te identificeren die overeenkomen met de pieklijst. Kies perMe als derivatisering, redEnd als de reducerende eind, en stel het minimum en maximum aantal verwachte residuen in.

Voor mucines, selecteer Hexose, N-Acetyl-Hexosamine, Deoxy-Hexose en N-Acetylneuraminic Acid. Voor sulfaat glycanen, gebruik de optie Andere residuen met een massa van 87,9. Voor MALDI-TOF gegevens, stel het maximum aantal natriumionen en ladingen in op een per stuk, en stel de nauwkeurigheid in op 0,5 Daltons.

Selecteer alle juiste annotaties met de Control toets en klik op elk van ze. Klik met de rechtermuisknop op de geselecteerde annotaties en kies Toevoegen aan de geannoteerde pieklijst. Om een rapport te genereren dat meerdere geannoteerde spectra vergelijkt, ga naar Tools gevolgd door Reporting en maak een rapport dat verschillende profielen vergelijkt.

Druk het rapport af als PDF om het op te slaan. Voor fragmentatiespectra analyse, laad de spectra op GlycoWorkbench en genereer de pieklijst zoals eerder gedemonstreerd. Teken putatieve glycanenstructuren die overeenkomen met de geannoteerde glycanencomposities.

Om fragmenten voor elke structuur te genereren, klik met de rechtermuisknop om Fragmenten naar canvas te kopiëren en kies Bereken fragmenten onder de Fragmenten tool. Voor verdere fragmentatieanalyse, klik op een piek van belang in de spectrumviewer. Klik met de rechtermuisknop en selecteer Alle structuren zoeken die overeenkomen met de pieken om de master charge verhouding van de geselecteerde piek te vragen tegen online databases.

Selecteer putatieve structuren van belang en klik met de rechtermuisknop om ze naar het canvasvenster te kopiëren met de juiste optie. Om mogelijke fragmenten van elke glycanenstructuur te berekenen, selecteer de structuur in het canvas. Kies vervolgens onder tools en fragmenten, bereken fragmenten voor de huidige structuur.

Al