Dubbele CRISPR-interferentiestrategie voor het richten op synthetische dodelijke interacties tussen niet-coderende RNA's in kankercellen

Ons doel is om systematisch kritieke netwerkhubs te identificeren en therapeutisch aan te pakken met een focus op niet-coderende RNA's bij kanker. De huidige experimentele uitdaging van onze aanpak ligt in de combinatorische capaciteit die nodig is om grote aantallen genen parallel te genereren en te screenen. We willen de weg vrijmaken voor het identificeren van nieuwe combinatorische niet-coderende RNA-targets of geneesmiddelbare structuren om resistentie en therapeutische ontsnapping te omzeilen.

In de toekomst zullen we deze proof of concept-tool vertalen naar grootschalige combinatorische bibliotheekscreening, mogelijk in combinatie met RNA-bindende eiwitten, zowel in vitro als in vivo. Tel om te beginnen Lenti-X 293T HEK-cellen met behulp van trypanblauwe kleurstof in een hemocytometer. Plaat 4 keer 10 tot de macht van 6 Lenti-X 293T HEK-cellen per 10 centimeter plaat en incubeer om de volgende dag ongeveer 80% samenvloeiing te bereiken.

Werk vanaf deze stap in een laboratorium van klasse 2. Meng 500 microliters van een geschikt transfectiemedium met overdrachtsvector, omhul plasmide en pPAX2-vector. Incubeer het mengsel gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur.

Meng in een aparte buis 500 microliter gereduceerd serummedium met 36 microliter PEI-reagens in een concentratie van 1 milligram per milliliter. Incubeer het mengsel gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Combineer de twee mengsels en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.

Voeg nu voorzichtig, druppelsgewijs, het mengsel toe aan het celmedium dat zes milliliter bevat en incubeer een nacht bij 37 graden Celsius in 5%kooldioxide. Gooi het medium na 12 tot 15 uur met behulp van een serologische pipet weg in een autoclaveerbare afvalfles. Spoel verbruiksartikelen, inclusief serologische pipetten en pipetpunten, af met een desinfecterende oplossing voordat u ze bij het autoclaafafval gooit.

Voeg vijf milliliter verse DMEM toe aan de getransfecteerde cellen met behulp van een nieuwe pipet. Om lentivirussen te oogsten, brengt u het bovenstaande over met behulp van een serologische pipet naar een canonieke buis van 50 milliliter, 48 uur na transfectie. Voeg vervolgens 5 milliliter vers medium toe aan de cellen en incubeer ze nog 24 uur.

Bewaar de tube in de koelkast. Herhaal na de incubatie het verzamelen van lentivirussen en voeg het samen met het eerder verzamelde monster. Na de derde oogst worden de gecombineerde supernatanten van alle drie de oogsten bij vier graden Celsius opgeslagen tot filtratie en centrifugatie.

Centrifugeer het gecombineerde supernatans gedurende 5 minuten bij 500 G en 4 graden Celsius in aërosoldichte containers en rotoren die zijn goedgekeurd voor organismen van risicogroep 2 en filtreer het supernatans vervolgens door spuitfilters van 0,2 micrometer steriele celkweekkwaliteit. Concentreer het gefilterde supernatans op 1000 G en vier graden Celsius met behulp van een centrifugaalfiltereenheid met een grenswaarde van 100 kilodalton molecuulgewicht tot ongeveer 500 microliter. Bewaar virusaliquots van 50 tot 100 microliter bij min 80 graden Celsius tot verder gebruik.

Plaat 501-mel cellen in een plaat met zes putjes 2 keer 10 tot de macht van 5 cellen per putje met een eindkweekvolume van 2 milliliter een dag voor transductie. Vervang het kweekmedium door 2 milliliter voorverwarmde DMEM aangevuld met polybreen in een eindconcentratie van 6 microgram per milliliter. Werk vanaf deze stap in een laboratorium van klasse 2.

Voeg tegelijkertijd 50 microliter bereide SPD- en SAD-lentivirussen druppelsgewijs toe aan de cellen. Schud de plaat voorzichtig en incubeer hem bij 37 graden Celsius in een atmosfeer van 5% koolstofdioxide. 16 uur na de transductie gooi het medium met behulp van een serologische pipet weg in een autoclaafbare fles.

Voeg 2 milliliter vers medium toe met 10 microgram per milliliter blasticidine en 2 microgram per milliliter puromycine. Herhaal de vervangingsstap van het medium na twee dagen en behandel getransduceerde cellen onder S1-omstandigheden na zeven dagen na transductie. Zaad 0,1 keer 10 tot de macht van 5 cellen met stabiele getransfecteerde SadCas9 KRAB en Sp-dCas9-KRAB zeven dagen na transductie in een plaat met 96 putjes met 100 microliter voorverwarmde DMEM.

Vervang op de dag van transductie het medium door 100 microliter voorverwarmde DMEM aangevuld met polybreen met 6 microgram per milliliter. Voeg het juiste volume lentivirussen toe aan de cellen en incubeer de plaat. Vervang het medium na 16 uur door een vers medium dat Zeoin, Blasticidine en puromycine bevat.

Voer luminescentiedetectie vijf dagen na de transductie uit met behulp van een cellevensvatbaarheidstest volgens de instructies van de fabrikant. Westerse bloedanalyse bevestigde succesvolle expressie van SpdCas9- en SadCas9-fusie-eiwitten in transducer 501-mel-cellen. Kwantitatieve polymerasekettingreactieanalyse toonde een effectieve knockdown van individuele lange niet-coderende RNA's RP11 en XLOC met behulp van specifieke gids-RNA's, maar alleen het XLOC-sa- en RP11-sp-paar onderdrukte beide doelen met succes tegelijkertijd.

Dubbele onderdrukking van RP11 en XLOC met behulp van het XLOC-sa en RP11-sp GRNA-paar verminderde de levensvatbaarheid van 501-mel cellen significant tot 59% in vergelijking met controle.