Een efficiënte methode voor het extraheren van epitelie van de menselijke eileider voor analyses van één cel

Onze onderzoeksfocus is het begrijpen en bestrijden van chemoresistentie bij eierstokkankers. We streven ernaar mechanismen en celsubpopulaties te ontdekken die resistentie aandrijven en nieuwe doelwitten om deze agressieve populaties uit te roeien.

Eencellige RNA-sequencing vergemakkelijkt de karakterisering van subpopulaties in heterogene eierstoktumoren. We maken gebruik van niet-kankerachtige eileiderepitheelcellen als cel van normale oorsprong voor analyses van eierstokkanker.

De efficiënte isolatie van eileiderepitheelcellen in een verrijkte eencellige suspensie zal helpen bij het beter begrijpen van het ontstaan van hooggradige sereuze eierstokkanker. Deze mechanische en enzymatische verteringstechniek biedt een efficiënter proces voor het extraheren van een verrijkte eencellige suspensie van levensvatbare eileiderepitheelcellen.

[Verteller] Verzamel om te beginnen verse menselijke eileiders in een buis van 15 of 50 milliliter met dissociatiemedia en plaats de buis op ijs. Breng de eileiders over in een steriel petrischaaltje met verse dissociatiemedia en plaats het monster onder een snijmicroscoop. Ontleed nu met behulp van een fijne punttang en een Vannas-Tübingen-schaar vet, bindweefsel en alle bloedvaten rond de buizen. Snijd vervolgens met een schaar door het coronale vlak van de eileiders om kleine cilinders te vormen met een diameter van drie tot vijf millimeter. Gebruik een fine=point-tang om het weefsel te stabiliseren tijdens het snijden. Zuig voorzichtig de dissociatiemedia op uit het schaaltje met de stukjes weefsel. Was de tissuestukken twee keer met twee milliliter koude 1x PBS en draai de plaat lichtjes. Na het opzuigen van de PBS, incubeer de weefselstukken gedurende vijf minuten in koude vijf millimolaire EDTA bij kamertemperatuur. Suspendeer de weefselfragmenten in koude 1% Trypsin Hanks Balanced Salt Solution en incubeer gedurende 40 minuten bij vier graden Celsius. Zuig de 1% Trypsin Hanks Balanced Salt Solution op en was de stukjes weefsel twee keer in koude dissociatiemedia om de trypsine te inactiveren. Incubeer de weefselfragmenten in twee milliliter dissociatiemedia met 0,4 milligram DNase gedurende ten minste 30 minuten bij kamertemperatuur. Houd onder een ontleedmicroscoop terwijl u zich nog in DNase-media bevindt, een fragment van de eileider vast met een tang zodat het lumen evenwijdig is aan de bodem van de schotel. Gebruik een tang om herhaaldelijk op het weefsel te drukken om epitheelcellen uit het lumen te verdrijven. Bevestig het vrijkomen van een halo van cellen rond het weefsel. Breng de mediabevattende cellen over in een steriele buis van 15 milliliter. Was de petrischaal twee keer met dissociatiemedia en combineer wasbeurten in dezelfde tube. Gooi de resterende stromale buisfragmenten weg. Om de cellen te oogsten, centrifugeer je ze gedurende vijf minuten op 500 g. Zuig het bovenstaande op en suspendeer de pellet in één milliliter dissociatiemedia. Meng nu 10 microliter celsuspensie met een gelijk volume trypanblauw. Pipetteer 10 microliter van het mengsel in een kamertelschuifje en plaats het in een cellenteller om het celgetal te bepalen. Resuspendeer de cellen in negen milliliter dissociatiemedia die collagenase type één en DNase bevatten. Incubeer 30 tot 45 minuten bij 37 graden Celsius in een orbitale shaker die is ingesteld op 200 RPM. Om de cellen te oogsten, centrifugeert u gedurende vijf minuten bij 500 g. Na het opzuigen van het supernatant, suspendeert u de pellet opnieuw in vijf milliliter dissociatiemedia om collagenase af te wassen. Leid de celsuspensie door een celzeef van 100 micrometer in een buis van 50 milliliter en centrifugeer het filtraat gedurende vijf minuten op 500 g. Als de celpellet rood lijkt, maak dan een RBC-lysisbuffer voor om de rode bloedcellen te lyseren. Zuig de media uit de pellet, voeg vijf milliliter van de verdunde RBC-lysisbuffer toe en incubeer het monster gedurende drie minuten op ijs. Om RBC-lysis te stoppen, voegt u 45 milliliter 1x PBS toe aan de buis. Centrifugeer de buis gedurende vijf minuten op 500 g. Na het oogsten en opnieuw suspenderen van de cellen in één milliliter dissociatiemedia, meng je 10 microliter van de celsuspensie met een gelijk volume trypanblauw. Pipetteer 10 microliter van het mengsel in een kamertelglaasje en plaats het in de cellenteller. Flowcytometrie-analyse bevestigde de isolatie van een levensvatbare en verrijkte epitheelcelpopulatie uit eileiderweefsel met een gemiddelde levensvatbaarheid van 82%. Na het verwijderen van CD45-positieve immuuncellen, vormden EpCAM-positieve epitheelcellen gemiddeld 80% van het monster, terwijl CD10-positieve stromale celbesmetting minimaal was met 7,8%. Geïsoleerde epitheelcellen vormden na vier tot zes dagen plateren aanhangende geplaveide clusters in 2D-cultuur, wat de epitheelidentiteit bevestigt. Immunochemie toonde aan dat de meeste gekweekte cellen EpCAM en PAX8 tot expressie brachten met slechts een paar vimentine-positieve cellen. Ciliated cellen waren aanwezig in cultuur.