High-throughput methode voor het observeren van motiliteitsfenotypes in Pseudomonas aeruginosa

Ons onderzoek richt zich op het begrijpen van hoe bacteriën werken en infecties veroorzaken met behulp van systeembiologie en genomica. We streven ernaar de genen te identificeren die de bacteriële fysiologie beïnvloeden in omstandigheden die de infectieomgeving nabootsen, om zo nieuwe doelwitten te vinden voor de ontwikkeling van betere antibiotica en alternatieve behandelingen. We ontwikkelden een high-throughput protocol om genetische factoren te identificeren die de motiliteit van Pseudomonas aeruginosa beïnvloeden, waardoor genoombrede analyse van zwerm- en twitching-gedrag mogelijk is. Dit onderzoeksinitiatief onthulde moleculaire mechanismen die de motiliteit aansturen en ook bijdragen aan de vorming van biofilms, kolonisatie en het ontwijken van de verdediging van de gastheer.

Het is aanpasbaar aan verschillende assays en bacteriesoorten. Om te beginnen neem je de bronplaten van de Pseudomonas aeruginosa transposon mutantenbibliotheek en laat je ze ongeveer een uur plat op kamertemperatuur liggen om af te koelen. Voor de gewenste test kies je M9 glucose 0,5% agarplaten voor zwermen en LB agar 1% agarplaten voor twitching.

Om de replicator te configureren voor nauwkeurige kolonieoverdracht, zet je de replicator aan. In de sectie selecteer en gebruik modus selecteer je opgeslagen programma's selecteren en uitvoeren. Selecteer in de sectie selecteer bronplaten, selecteer plus plaat 384 agar.

Selecteer vervolgens in het gedeelte 'selecteer doelplaat' plus plaat 384 agar. Selecteer in de sectie 'selecteer pads' korte pin 384. In singer-programma's selecteer je 'repliceer veel', ga dan naar 'replicate'-opties en kies algemeen, recyclen en geen.

Selecteer in de sectiebron offset, vervolgens willekeurig en standaardstraal. Selecteer in het sectiedoel pinning en stel de druk aan naar 2%. Laat alle andere instellingen standaard. Steek vervolgens de korte pin RePads 384 in het juiste compartiment.

Plaats de bron- en doelplaten op het aangewezen platform van de replicator. Plaats de bronplaten met 384 dichtheid en de lege motiliteitsplaten op het platform. Druk op de uitvoering met de geselecteerde parameters om het overdrachtsproces te starten.

De microbiële array-pinningrobot zal kolonies overbrengen van de bronplaten met 384 dichtheid naar de motiliteitsplaten. Daarna plaats je de geïnënte motiliteitsplaten in plastic zakken. Plaats voorzichtig de zakken met de platen in de broedmachine, ingesteld op 37 graden Celsius gedurende 18 uur.

Na de incubatietijd maakt u hoge-resolutie beelden van de motiliteitsplaten met behulp van hoogwaardige beeldvormingssoftware. Na het uitvoeren van de motiliteitstest en het afbeelden van de motiliteitsplaten, voer je de macro uit in ImageJ. Open de map met de afbeeldingen om de batch te laden voor analyse.

Als je erom vraagt, pas je de hoek aan met de preview-optie totdat de plaat recht staat om de rotatie van de plaat aan te passen. Als je tevreden bent, klik dan op de oké-knop. Beweeg vervolgens het rechthoekige gereedschap rond de kolonies om het deel van de plaat met de kolonies te besnijden.

Als je klaar bent, klik je op oké om het bijsnijden te voltooien. Definieer het raster dat wordt gebruikt om het regio van interesse, of ROI, rond elke kolonie te tekenen en meet het motiliteitsgebied. Selecteer de juiste koloniedichtheid en pas de parameters aan om ervoor te zorgen dat elke cirkel rond een kolonie wordt geplaatst.

Als je klaar bent, activeer je het oké-vakje en klik je op de oké-knop. Het motiliteitsgebied van elke kolonie wordt gemeten en een CSV-bestand met de gegevens wordt opgeslagen in de aangewezen map. Voor motiliteitstest autoclaven we een agaroplossing met M9, glucose, casaminozuren en magnesiumsulfaat.

Giet 25 milliliter van de afgekoelde, gemengde agar in elke Petri-plaat. Inoculeer vervolgens elke plaat met 2,5 microliter bacteriële kweek over een nacht en incubeer 18 uur bij 37 graden Celsius met de deksels naar boven gericht om motiliteitsfenotypes te observeren. Na het autoclaven van een oplossing van LB met 1% agar, giet je 25 milliliter van de gekoelde, gemengde LB 1%agar in petriplaten.

Steek bacteriën in de onderkant van de trillende platen die 1% agar bevatten. Incubeer de platen 48 uur op 37 graden Celsius, en daarna nog eens 48 uur op kamertemperatuur. Na het incuberen verwijder je voorzichtig de agar van de platen.

Visualiseer de twitching zone door de petrischaal te kleuren met 1% kristalviolette oplossing. De twitching motility assay toonde aan dat Pseudomonas aeruginosa-mutanten met T4P-machinerie-gendeleties significant kleinere halo-regio's vertoonden vergeleken met het wilde type, wat wijst op verminderde twitchingmotiliteit. Swarming motility analyse toonde aan dat deletiemutanten van de PA14-bibliotheek significant verminderde halo-regio's zonder uitsteeksels hadden, wat een defect swarming-vermogen bevestigde.

Bacteriële motiliteitsstudies worden vaak beperkt door hun doorvoersnelheid. Ons high-throughput motiliteitsprotocol helpt onderzoekers om bacteriële motiliteit grondig te bestuderen. Door bijvoorbeeld een genoombrede mutantencollectie te gebruiken, wordt het mogelijk om alle genen die met motiliteit te maken hebben te identificeren en te onthullen hoe bacteriën infecties veroorzaken.

Onze bevindingen roepen nieuwe vragen op over de genetische controle van de motiliteit bij Pseudomonas aeruginosa, de rol ervan in de vorming van biofilms en de verbinding met pathogenese. Ze helpen ook bij het onderzoeken van hoe omgevingscondities motiliteitsgedrag beïnvloeden, en of het richten op motiliteitsgenen kan leiden tot innovatieve antimicrobiële therapieën.