Het opzetten van een driedimensionale cocultuurmodule van epitheelcellen met behulp van nanovezelmembranen

Onze onderzoeksgroep gebruikt polyvinylalcohol, PVA en poly epsilon-caprolacton, PCL, nanovezelmembranen om een 3D-cocultuursysteem te ontwikkelen. Het heeft tot doel te beantwoorden hoe de membranen epitheel- en fibroblastcellen ondersteunen, weefselomgevingen nabootsen en de studie van patroonsignalering en cellulaire interacties vergemakkelijken. We zullen aantonen dat poreuze, elektrogesponnen nanovezelmembranen ervoor zorgen dat epitheelcellen epitheelweefsel kunnen vormen, waardoor meerdere lagen kunnen groeien, en fibroblasten kunnen groeien in elke extra matrix.

De methoden laten zien hoe een uitgebreid 3D-systeem groeiend weefsel een betere omgeving kan bieden in vergelijking met traditionele tot 2D-culturen. Wij bieden een cocultuursysteem aan waarbij gebruik wordt gemaakt van gedifferentieerde epitheelcellen. Het organiseren met behulp van stamcellen vereist een complexe differentiatieprocedure, maar ons model heeft voordelen in eenvoud en tijdwinst bij de ontwikkeling van een 3D-cocultuursysteem.

We richten ons op het overwinnen van de beperking van nanovezelachtige steigers door nanovezelmembranen te combineren met overlaaghydrogels in de coculturen. Voeg om te beginnen 0,02 gram polyacrylzuur en één gram PVA toe aan een schone glazen fles met een magnetische staaf. Voeg 7,8 milliliter gedestilleerd water toe aan de fles en plaats de fles op een roerder.

Zodra de fles is afgekoeld tot kamertemperatuur, voeg je er 0.2 milliliter glutaaraldehyde aan toe en plaats je deze terug op de plaatroerder bij 500 RPM gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Gebruik een spuit van vijf milliliter voor elektrospinning. Scheid de plunjers van de vaten en verwijder klein plastic vuil in de vaten en de uiteinden van de plunjers.

Gebruik vervolgens naalden om de vloeistofstroom te blokkeren en giet de PVA-oplossing in elk spuitvat. Monteer de zuigers in de vaten en verwijder de naalden. Nadat u een nieuwe 27 gauge metalen naald in elkaar hebt gezet, plaatst u deze in de elektrospinmachine.

Wikkel de collector stevig in met aluminiumfolie. Zodra het injectorpaneel terugkeert naar zijn oorspronkelijke positie, stelt u de elektrospinmachine in op een injectievolume van twee milliliter, een injectiesnelheid van zes microliter per minuut, een rolsnelheid van 100 RPM en een afstand van de tip tot de collector van 14 centimeter. Controleer de vloeistofstroom voor elke pomp en laat vervolgens de elektrospinmachine draaien met een elektrisch potentiaal van ongeveer 12 kilovolt.

Nadat het elektrospinnen is voltooid, maakt u de folie met de vezelmat los van de opvangbak. Bewaar de nanovezelmat in een droogmiddel onder vacuüm. Voeg 1,5 gram PCL en 8,5 milliliter chloroform toe aan een schone glazen fles.

Plaats de fles op een roerstaafje en los de PCL in chloroform gedurende 12 uur op bij kamertemperatuur. Snijd een klein stukje van het nanovezelmembraan af, bedek de stukjes met een dunne goudlaag met behulp van het automatische sputterproces gedurende vijf minuten. Snijd om te beginnen de gefabriceerde PVA-nanovezelmat in stukken van de gewenste grootte voor het transwell-inzetstuk.

Bereid een klein gerecht met 1,5 milliliter puur zoutzuur. Plaats de schaal met zoutzuur en de stukjes nanovezel in een vacuümkamer en sluit het deksel. Open vervolgens de klep die is aangesloten op de vacuümpomp en wacht 10 seconden tot zoutzuurdampen opstijgen.

Sluit de klep en behandel de membranen gedurende twee minuten met zoutzuurdampen. Voeg na de zoutzuurbehandeling druppels gedestilleerd water toe aan de membranen. Leg de membranen op een glasplaatje en haal ze uit de folie.

Gebruik een auto sputter coater om de membranen op carbontape te bedekken met een dun laagje goud. Was vervolgens de PVA-nanomembranen die verknoopt zijn met zoutzuur drie keer met PBS en week ze in de kweekmedia. Controleer na het weken de pH om de afwezigheid van resterend zoutzuur te bevestigen.

Snijd om te beginnen de nanovezelmatten in ronde stukken met een diameter van 10 millimeter voor PVA-nanomembranen en 13 millimeter voor PCL-nanomembranen. Meng SYLGARD 184 basis en uithardingsmiddel in een verhouding van 10 op 1 massa in een plastic beker. Gebruik een schoon glasplaatje om de polydimethylsiloxaan, of PDMS-oplossing, gedurende twee tot drie minuten krachtig te mengen tot er belletjes ontstaan.

Verdeel het PDMS gelijkmatig over een glasplaatje. Dompel de onderkant van het inzetstuk goed in het PDMS. Plaats het inzetstuk vervolgens goed ondersteboven op de diawarmer gedurende 10 tot 15 minuten totdat het PDMS hard is.

Controleer het PDMS met een pipetpunt van 200 microliter om er zeker van te zijn dat het niet langer plakkerig is. Druk nu het inzetstuk voorzichtig goed op het PVA-nanomembraanstuk, zodat de onderkant van het inzetstuk goed naar de nanovezelzijde van het membraan wijst. Voeg een druppel gedestilleerd water toe aan het midden van de put en gebruik een tang om de folie voorzichtig te verwijderen.

Plaats het inzetstuk vervolgens goed in een nieuwe plaat met 24 putjes en laat het membraan drogen. Dompel bij het bevestigen van het nanomembraanstuk een pipetpunt van 200 microliter in het PDMS-mengsel en stippel het precies op de vier hoeken en in het midden van de put. Plaats de plaat op de glijverwarmer en laat de PDMS vijf tot zeven minuten uitharden.

Plaats vervolgens het PCL-nanomembraanstuk in de PDMS-put met de nanovezelzijde bevestigd aan het PDMS. Gebruik een kleine, schone borstel om de foliezijde van het membraan lichtjes aan te drukken voor een volledige bevestiging. Voeg vervolgens 0,2 milliliter 70% ethanol toe aan de put om de folie gemakkelijker te verwijderen.

Steriliseer het inzetstuk en de bodemput 's nachts in de transwell-opstelling onder ultraviolet licht. Was de volgende dag het inzetstuk en de bodem goed door 200 microliter PBS aan het inzetstuk en 500 microliter aan het bodemvak toe te voegen gedurende drie cycli van elk 10 minuten. Zodra de cellen 70 tot 80% samenvloeiing bereiken, wast u ze met 10 milliliter PBS en voegt u twee milliliter 0,05% trypsine EDTA toe om ze te trypsiniseren.

Tik zachtjes op de schaal om de cellen van de bodem los te maken. Voeg acht milliliter complete kweekmedia toe om het trypsine-enzym te neutraliseren en breng de celsuspensie vervolgens over in een centrifugebuis van 50 milliliter. Centrifugeer de buis gedurende vijf minuten op 400G.

Nadat u de supra natant hebt weggegooid, suspendeert u de celpellet opnieuw in vijf milliliter volledige DMEM met F12-media. Vul vervolgens de bodem goed met 500 microliter complete DMEM F12 media. Breng het PVA-nanovezelmembraan bevestigde inzetstuk over op de transwell en voeg 50 microliter MLE-12-celsuspensie toe.

Vul vervolgens het PCL-nanovezelmembraan dat aan de onderkant is bevestigd goed met 500 microliter NIH3T3-celsuspensie. Na twee uur incubatie van de cellen, monteert u de MLE-12-cel met insert en de NIH3T3-cel met bodemput in de transwell-opstelling, De ruimtelijke verdeling van NIH3T3-cellen en MLE-12-cellen in het cocultuursysteem was duidelijk te onderscheiden, met groene NIH3T3-cellen verspreid op verschillende diepten en rode MLE-12-cellen die lagen vormden. NIH3T3-cellen infiltreren het PCL-nanovezelmembraan en strekken zich uit langs de nanovezelassen, terwijl MLE-12-cellen zich hechten aan het oppervlak van het PDA-nanovezelmembraan en een aggregatie vertonen.