Extractie van de Young's Modulus van inheemse muizen pulmonale basaalmembranen uit door atoomkrachtmicroscopie afgeleide krachtkaarten

In ons onderzoek onderzoeken we de invloed van de mechanische eigenschappen van de extracellulaire matrix op celgedrag en weefselintegriteit. We willen begrijpen hoe het samenspel tussen cellen en hun micro-omgeving pathologische processen zoals metastasevorming beïnvloedt. Door de mechanische eigenschappen van het longbasale membraan te dataminen, ontdekten we dat zachtere basaalmembranen beter bestand zijn tegen invasie van kankercellen.

De methode die in ons protocol wordt gepresenteerd, maakt cryosectie en mechanisch onderzoek van niet-gefixeerde biologische monsters mogelijk, waardoor de mechanische eigenschappen behouden blijven. En bovendien toont het een manier om de Young's modulus uitsluitend van het basaalmembraan in de alveolaire wand te bepalen door middel van een atoomkrachtmicroscoop en filterprocedures die in ons protocol worden beschreven. De volgende stap is om meer te weten te komen over de dynamiek van basale membraanstijfheid en de rol ervan in ontwikkelings- en pathologische processen om de diagnostiek mogelijk te verbeteren en behandelingsopties te begeleiden.

Verwijder om te beginnen de mal met de bevroren optimale snijtemperatuur, of OCT, samengestelde ingebedde longweefsels van muizen uit de vriezer van min 80 graden Celsius. Plaats dubbelzijdig plakband in het midden van het microscoopglaasje met matte rand. Rol een centrifugebuis van 15 milliliter over de tape voor een stevige en luchtbelvrije hechting.

Zorg ervoor dat de lengte van de tape overeenkomt met de breedte van het OCT-blok met het monster. Label de dia's met een potlood, inclusief de voorbeeldinformatie en sectienummers. Plaats de voorbereide microscoopglaasjes in een objectglaasjesdoos.

Plaats de glaasjesdoos in de cryotoomkamer om de objectglaasjes af te koelen. Vul vervolgens de binnenste twee ringen van de monsterhouder met OCT-medium. Plaats het monster in het OCT-medium op de monsterhouder.

Plaats de monsterhouder ongeveer 10 minuten in de cryotoomkamer totdat het OCT-medium volledig is gestold en het monster stevig is vastgezet. Installeer nu de monsterhouder op de snijfase van de cryotoom. Bevestig een stuk eenzijdig plakband aan het monster door stevig aan te drukken met een koele duim.

Produceer een weefseldoorsnede van 15 micrometer met behulp van de cryotoom. Gebruik een borstel om het gedeelte te richten en voorkom dat het plakband loskomt tijdens het snijden. Gebruik een gekoeld microscoopglaasje met dubbelzijdig plakband en druk het stevig op het gedeelte om het op te pakken.

Plaats de dia die het gedeelte terug draagt in de diadoos. Om de cantilever te kalibreren met behulp van de thermische ruismethode, plaatst u een microscoopglaasje op de monstertrap van de atoomkrachtmicroscoop of AFM. Plaats de AFM-kop op de monsterfase.

Laat vervolgens de AFM-kop zakken met behulp van de stappenmotoren totdat de opening tussen de vrijdragende houder en het microscoopglaasje ongeveer één tot twee millimeter is. Gebruik een spuit van één milliliter met een lange naald om PBS aan de zijkant van de draagarmhouder aan te brengen, zodat deze naar beneden kan stromen en een vloeibare meniscus in de opening kan vormen. Om in de AFM-besturingssoftware een kalibratie op basis van contacten uit te voeren, navigeert u naar de pagina Gegevens verkrijgen en selecteert u de optie Geavanceerde weergave.

Open de Calibration Manager door op de hamburgermenuknop in de rechterbovenhoek te klikken. Selecteer vervolgens Contact-gebaseerd als de methode en MLCT-F cantilever in het vervolgkeuzemenu Naam als de cantilevernaam. Voer één volt in het veld Setpoint in en 10 in het veld Aantal scans.

Voer op de pagina Gegevens ophalen een instelpunt van één volt in voor de automatische naderingsprocedure op het linkerbedieningspaneel. Klik op de blauwe pijl naar beneden in de linkerbovenhoek van de interface om de automatische nadering te starten. Wanneer de aanpak is voltooid en de cantilever in contact is met het microscoopglaasje, klikt u op de knop Kalibreren in het venster Kalibratiebeheer om de kalibratie te starten.

Nadat de kalibratie is voltooid, sluit u het venster van de Calibration Manager en zorgt u ervoor dat er een kalibratiebestand wordt gegenereerd in de vooraf geselecteerde map met de vastgestelde kalibratieresultaten. Haal om te beginnen het preparaatglaasje met doorgesneden muizenlongweefsel uit de vriezer. Plaats het microscoopglaasje op de monsterfase van de AFM.

Klik op de knop met het moersleutelpictogram in de rechterbovenhoek van de gebruikersinterface om naar Instellingenbeheer te gaan. Stel in het gedeelte Naderingsinstellingen de doelhoogte in op vier micrometer. Stel vervolgens in het gedeelte Instellingen voor huidige modus onder Geavanceerde feedbackinstellingen de vermenigvuldiger in op één.

Selecteer in de subsectie Krachtinstellingen van de huidige modusinstellingen de optie Ingetrokken piëzo in het vervolgkeuzemenu Modus aan het einde. Stel op het linkerbedieningspaneel de parameters in voor de krachtindrukkingscurves. Voor de NanoWizard 4 XP en de MLCT cantilever F voer Setpoint in op vijf nanonewton, Z Lengte op acht micrometer en Z Velocity op 300 micrometer per seconde.

Definieer vervolgens de locatie en grootte van de eerste overzichtskrachtkaart die de gehele alveolaire wand omvat, die zich uitstrekt van de ene luchtzijde naar de andere. Stel het aantal pixels in op 50 bij 50. Na het opnemen van de overzichtskaart, legt u een meer gefocuste krachtkaart vast met een grootte van drie bij drie micrometer of vier bij vier micrometer op het basaalmembraan, waarbij u het aantal pixels op 50 bij 50 curven houdt.

Om de indrukkingscurven van de kracht te analyseren, start u de CANTER Processing Toolbox in MATLAB en opent u de toepassing Force Curve Analysis. Als u vervolgens de krachtkaart met hoge resolutie van de longsectie wilt laden, klikt u op Bestand selecteren, navigeert u naar de opslaglocatie, dubbelklikt u op het bestand en selecteert u Gegevens laden. Wanneer het pop-upvenster verschijnt waarin om kalibratiewaarden voor de cantilever wordt gevraagd, voert u de kalibratiewaarden in de respectievelijke bewerkingsvelden in.

Klik op de knop Verzenden om verder te gaan. Ga in een tweede pop-upvenster verder met de laadprocedure van de kwantitatieve beeldvormingskaart (QI) door op de knop Verzenden te klikken. Na voltooiing van het laadproces wordt de initiële krachtcurve van de krachtkaart op het scherm weergegeven.

Stel de pasdiepte in het bijbehorende bewerkingsveld in op 1,5 micrometer en selecteer via Hertz geschikt voor het algoritme van de contactzoeker. Als u de pasvorm van het gewijzigde Hertz-model wilt toepassen op alle krachtinspringingscurven van de QI-toewijzing, klikt u op de knop Toepassen op alles behouden. Na voltooiing van de laatste krachtcurve-analyse verschijnt er een venster om de bestanden op te slaan.

Klik op Ja en voer een naam in voor de resultaatbestanden. Voor het ruimtelijk filteren van de QI-toewijzing vanuit het venster Toepassingsselectie in de CANTER Processing Toolbox, selecteert u de Resultaatfiltertool en klikt u op de knop Toepassing starten. Om de pasresultaten te laden, klikt u op Openen in de bovenste menubalk van de gebruikersinterface van de Result Filtering Tool.

Zoek in het daaropvolgende pop-upvenster de eerste Set-knop onder het tabblad JPK Maps en selecteer het tsv-bestand met de resultaten van de krachtcurve-analyse. Klik vervolgens op de tweede Set-knop en zoek het QI-kaartbestand dat overeenkomt met het geselecteerde tsv-bestand. Klik vervolgens op Verzenden om de kaartgegevens en de resultaten van de krachtcurveanalyse te laden.

Selecteer in het vervolgkeuzemenu Weergegeven kanaal bovenaan de optie EModul om de modulusresultaten van Young als een kaartafbeelding weer te geven. Kies vervolgens in het vervolgkeuzemenu Gegevenskanaal onder de histogramplot de optie EModul om de verdeling van de geladen Young's moduluswaarden van de QI-kaart te visualiseren. Klik vervolgens op de pijlknop Manipulatiestroom in het midden van de gebruikersinterface en zorg ervoor dat deze naar de rechterkant wijst.

Stel de schakelknop Afbeeldingsfilter in op Aan in het deelvenster Filter boven de histogramassen. Selecteer in het vervolgkeuzemenu Geometrie filteren de optie Uit de vrije hand en klik vervolgens op de knop Toevoegen. Teken op de afbeelding van het bovenste kanaal het filtermasker door het basaalmembraan te omcirkelen terwijl u de linkermuisknop ingedrukt houdt.

Laat vervolgens de muisknop los als u klaar bent en dubbelklik op het masker om het op de kaart toe te passen. Als u een nieuw tsv-resultaatbestand wilt opslaan met de gemaskeerde moduluswaarden van Young, klikt u op Opslaan, Histogram opslaan en Gegevens opslaan in de bovenste menubalk. Klik in het pop-upvenster dat verschijnt op Alles selecteren om te kiezen welke resultaten naar het tsv-bestand moeten worden geschreven.

Klik vervolgens op de knop OK om de selectie te bevestigen. Voer in het dialoogvenster Opslaan een naam in voor het tsv-bestand, kies de gewenste opslaglocatie en klik op OK om de gefilterde resultaten op te slaan. De Young's moduluswaarden van het pulmonale basaalmembraan vertoonden een log normale verdeling met een piekwaarde van 9,31 en een standaarddeviatie van 0,18, wat een representatieve Young's modulus van 11,05 kilopascal opleverde.

Deze bevindingen werden verder bevestigd door een kwantiel-kwantielplot.