Generatie van driedimensionale sferoïden/organoïden uit tweedimensionale celculturen met behulp van een nieuw stempelapparaat

Het doel van ons onderzoek is het opstellen van een efficiënt en reproduceerbaar protocol voor het genereren van driedimensionale celculturen met behulp van een innovatief stapsgewijs microtitersysteem in agaroseschimmels. We streven ernaar om te beantwoorden hoe we een vereenvoudigde, gecontroleerde omgeving kunnen creëren die uniforme, hoogwaardige 3D-culturen bevordert voor het testen van geneesmiddelen, gentechnologie en aanverwante toepassingen. Recente ontwikkelingen in 3D-celkweeksystemen verbeteren celinteracties en creëren meer in vivo-achtige omgevingen.

Deze aanpak verbetert de vorming van sferoïde organoïden, waardoor het een veelbelovend hulpmiddel is voor biomedisch onderzoek. De huidige technologieën voor 3D-celcultuur omvatten hangende druppels, roterende celcultuur, kunststoffen met een lage bevestiging, platen met conische putjes, microporeuze steigers, magnetische kralen en steigervrije hydrogels. Deze methoden maken de vorming van 3D-celstructuren mogelijk, elk met zijn eigen voordelen en beperkingen.

Ons protocol gaat in op de uitdaging om op grote schaal uniforme 3D-sferoïden en organoïden te genereren met een consistente grootte en kwaliteit. Het lost problemen op met levensvatbaarheid en celdichtheid, het omgaan met problemen en instabiliteit tijdens het proces en blijkt een kosteneffectieve, reproduceerbare oplossing te zijn voor betrouwbaar onderzoek naar 3D-celculturen. We zetten ons in voor verbetering van onderzoeksinstrumenten, het genereren van sferoïden-organoïden van insulineproducerende bètacellen voor in-vitro-analyse en inkapseling in biopolymeren, gericht op omkering van diabetes type I en het genereren van sferoïden-organoïden uit triple-negatieve menselijke borstkankercellen als een screeningsplatform voor geneesmiddelen voorafgaand aan de behandeling van de patiënt.

Ontwerp het stempelapparaat met behulp van de opgegeven software. Was de op maat gemaakte stempel met een zachte borstelspons en gedestilleerd water om eventuele resten te verwijderen. Stel de schone stempel vijf tot 10 minuten bloot aan ultraviolet licht om steriliteit te garanderen.

Om 1 tot 2% agarose-oplossing te bereiden, weegt u de benodigde hoeveelheid puur agarosepoeder af en lost u het op in PBS. Verwarm de oplossing in een magnetron tot de agarose volledig is opgelost. Piket vervolgens ongeveer drie milliliter van de 40 graden Celsius agarose-oplossing in elk putje van een plaat met zes putjes.

Plaats de stempel in het midden van het kuiltje en laat de agarose 5 tot 10 minuten stollen. Verwijder na het stollen de stempel met zachte heen en weer gaande bewegingen om het vacuüm op te heffen zonder de microwells te beschadigen. Was de microwells drie keer met PBS om resten te verwijderen.

Stel de plaat gedurende 10 minuten bloot aan ultraviolet licht om microbiële besmetting te elimineren. Voeg drie milliliter kweekmedium toe aan elk putje van de plaat met zes putjes en incubeer de plaat een nacht bij 37 graden Celsius in een kooldioxide-incubator. Om een homogene suspensie van pancreaseilandjes van varkens te verkrijgen, voegt u trypsine toe aan een tweedimensionale celcultuur om de cellen te dissociëren.

Tel vervolgens de cellen en pas de concentratie aan om het gewenste aantal cellen per microwell van een plaat met zes putjes te bereiken. Pipetteer drie milliliter van de celsuspensie over de agarose-microwells en draai de plaat rond om een gelijkmatige verdeling te garanderen. Laat de cellen 10 tot 15 minuten door de zwaartekracht bezinken.

Bekijk vervolgens de bezonken cellen onder de microscoop. Incubeer de plaat bij 37 graden Celsius in een 5% koolstofdioxide incubator. Vervang elke twee tot drie dagen 50% van het oude of gebruikte medium door vers medium.

Ga door met kweken totdat compacte, driedimensionale structuren volledig zijn gevormd. Om sferoïden of organoïden te verzamelen, verwijdert u het kweekmedium en verzamelt u met behulp van een gesneden pipetpunt de driedimensionale structuren door krachtig te pipetteren. Compacte driedimensionale structuren werden met succes gevormd door 48 uur kweken in agarose-microwells, zoals waargenomen door tijdsafhankelijke celaggregatie.

Levensvatbare driedimensionale structuren bleven behouden bij verwijdering uit agarose-microwells, waarbij groene kleuring aangaf dat er levende cellen in de structuren waren, wat de levensvatbaarheid en stabiliteit van de cellen bevestigde.