Generatie van driedimensionale sferoïden/organoïden uit tweedimensionale celculturen met behulp van een nieuw stempelapparaat
March 28th, 2025
Deze studie presenteert een kosteneffectieve en efficiënte methodologie voor het genereren van 3D-celstructuren met behulp van een op stempels gebaseerd systeem om microwells in agaroseschimmels te maken. Het systeem bevordert de vorming van uniforme sferoïden/organoïden, waardoor de celinteracties worden verbeterd. Deze aanpak vermindert de experimentele variabiliteit en ondersteunt toepassingen in het testen van geneesmiddelen en weefselmanipulatie.
Het doel van ons onderzoek is het opstellen van een efficiënt en reproduceerbaar protocol voor het genereren van driedimensionale celculturen met behulp van een innovatief stapsgewijs microtitersysteem in agaroseschimmels. We streven ernaar om te beantwoorden hoe we een vereenvoudigde, gecontroleerde omgeving kunnen creëren die uniforme, hoogwaardige 3D-culturen bevordert voor het testen van geneesmiddelen, gentechnologie en aanverwante toepassingen. Recente ontwikkelingen in 3D-celkweeksystemen verbeteren celinteracties en creëren meer in vivo-achtige omgevingen.
Deze aanpak verbetert de vorming van sferoïde organoïden, waardoor het een veelbelovend hulpmiddel is voor biomedisch onderzoek. De huidige technologieën voor 3D-celcultuur omvatten hangende druppels, roterende celcultuur, kunststoffen met een lage bevestiging, platen met conische putjes, microporeuze steigers, magnetische kralen en steigervrije hydrogels. Deze methoden maken de vorming van 3D-celstructuren mogelijk, elk met zijn eigen voordelen en beperkingen.
Ons protocol gaat in op de uitdaging om op grote schaal uniforme 3D-sferoïden en organoïden te genereren met een consistente grootte en kwaliteit. Het lost problemen op met levensvatbaarheid en celdichtheid, het omgaan met problemen en instabiliteit tijdens het proces en blijkt een kosteneffectieve, reproduceerbare oplossing te zijn voor betrouwbaar onderzoek naar 3D-celculturen. We zetten ons in voor verbetering van onderzoeksinstrumenten, het genereren van sferoïden-organoïden van insulineproducerende bètacellen voor in-vitro-analyse en inkapseling in biopolymeren, gericht op omkering van diabetes type I en het genereren van sferoïden-organoïden uit triple-negatieve menselijke borstkankercellen als een screeningsplatform voor geneesmiddelen voorafgaand aan de behandeling van de patiënt.
Ontwerp het stempelapparaat met behulp van de opgegeven software. Was de op maat gemaakte stempel met een zachte borstelspons en gedestilleerd water om eventuele resten te verwijderen. Stel de schone stempel vijf tot 10 minuten bloot aan ultraviolet licht om steriliteit te garanderen.
Om 1 tot 2% agarose-oplossing te bereiden, weegt u de benodigde hoeveelheid puur agarosepoeder af en lost u het op in PBS. Verwarm de oplossing in een magnetron tot de agarose volledig is opgelost. Piket vervolgens ongeveer drie milliliter van de 40 graden Celsius agarose-oplossing in elk putje van een plaat met zes putjes.
Plaats de stempel in het midden van het kuiltje en laat de agarose 5 tot 10 minuten stollen. Verwijder na het stollen de stempel met zachte heen en weer gaande bewegingen om het vacuüm op te heffen zonder de microwells te beschadigen. Was de microwells drie keer met PBS om resten te verwijderen.
Stel de plaat gedurende 10 minuten bloot aan ultraviolet licht om microbiële besmetting te elimineren. Voeg drie milliliter kweekmedium toe aan elk putje van de plaat met zes putjes en incubeer de plaat een nacht bij 37 graden Celsius in een kooldioxide-incubator. Om een homogene suspensie van pancreaseilandjes van varkens te verkrijgen, voegt u trypsine toe aan een tweedimensionale celcultuur om de cellen te dissociëren.
Tel vervolgens de cellen en pas de concentratie aan om het gewenste aantal cellen per microwell van een plaat met zes putjes te bereiken. Pipetteer drie milliliter van de celsuspensie over de agarose-microwells en draai de plaat rond om een gelijkmatige verdeling te garanderen. Laat de cellen 10 tot 15 minuten door de zwaartekracht bezinken.
Bekijk vervolgens de bezonken cellen onder de microscoop. Incubeer de plaat bij 37 graden Celsius in een 5% koolstofdioxide incubator. Vervang elke twee tot drie dagen 50% van het oude of gebruikte medium door vers medium.
Ga door met kweken totdat compacte, driedimensionale structuren volledig zijn gevormd. Om sferoïden of organoïden te verzamelen, verwijdert u het kweekmedium en verzamelt u met behulp van een gesneden pipetpunt de driedimensionale structuren door krachtig te pipetteren. Compacte driedimensionale structuren werden met succes gevormd door 48 uur kweken in agarose-microwells, zoals waargenomen door tijdsafhankelijke celaggregatie.
Levensvatbare driedimensionale structuren bleven behouden bij verwijdering uit agarose-microwells, waarbij groene kleuring aangaf dat er levende cellen in de structuren waren, wat de levensvatbaarheid en stabiliteit van de cellen bevestigde.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Deze studie presenteert een kosteneffectieve methodologie voor het genereren van 3D-celstructuren met behulp van een op stempels gebaseerd microwell-systeem in agarose mallen. Deze aanpak verbetert de vorming van sferoïden en organoïden, verbetert celinteracties en vermindert experimentele variabiliteit.
Belangrijke onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Celkweek
- Weefseltechniek
- Geneesmiddelentesten
Achtergrond
- 3D-celcultuursystemen verbeteren omgevingen die lijken op in vivo-omgevingen.
- Huidige technologieën omvatten hangende druppels en scaffold-vrije hydrogels.
- Elke methode heeft zijn voordelen en beperkingen.
- Uniforme, hoogwaardige 3D-culturen zijn essentieel voor biomedisch onderzoek.
Doel van het onderzoek
- Om een reproduceerbaar protocol voor 3D-celculturen vast te stellen.
- Om een gecontroleerde omgeving te creëren voor geneesmiddelentesten en gentechniek.
- Om de vorming van sferoïden en organoïden te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Stempelgebaseerd systeem voor het maken van microwells.
- Agarose mallen voor celkweek.
- Evaluatie van celinteracties en sferoïdvorming.
- Vergelijking met bestaande 3D-cultuurtechnologieën.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle vorming van uniforme sferoïden/organoïden.
- Verminderde experimentele variabiliteit in celculturen.
- Verbeterde celinteracties in 3D-omgevingen.
- Mogelijke toepassingen in geneesmiddelentesten en weefseltechniek.
Conclusies
- Het op stempels gebaseerde microwell-systeem is effectief voor 3D-celcultuur.
- Deze methodologie ondersteunt ontwikkelingen in biomedisch onderzoek.
- Toekomstige studies kunnen verdere toepassingen in verschillende vakgebieden verkennen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Standardized 3D spheroid and organoid generation is critical for predictive drug testing and translational tissue engineering. The novel stamp-based microwell system enables scalable, reproducible formation of uniform 3D cell structures, directly addressing variability and throughput challenges in early discovery and preclinical workflows. This platform supports robust in vitro modeling, enhancing confidence in downstream screening and mechanistic studies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables formation of physiologically relevant 3D cell models for hypothesis-driven interrogation.
- Reduces biological variability, supporting functional target validation and mechanistic de-risking.
- Facilitates portfolio triage by providing consistent, high-quality data from uniform spheroids.
Screening & Assay Development
- Prepares standardized 3D biological systems for high-content drug screening and compound evaluation.
- Improves assay reproducibility and quantitative output by minimizing size and quality variability.
- Supports scalable workflows with high microwell density, enabling parallelized testing and platform reuse.
Translational & Preclinical Research
- Provides disease-relevant 3D models for translational biomarker studies and preclinical validation.
- Ensures continuity from discovery through preclinical assessment by maintaining consistent culture conditions.
- De-risks advancement decisions by generating robust, reproducible in vitro data aligned with in vivo relevance.
Pipeline & Workflow Integration
This microwell-based 3D culture method integrates from early discovery through lead identification and preclinical research, supporting both target validation and screening inflection points.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification using uniform 3D models.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for reliable compound comparison.
- Analytics: Enables consistent measurement of spheroid formation, viability, and response to interventions.
- Translational Research: Aligns in vitro models with disease-relevant biology for biomarker and efficacy studies.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, cost-effective platform adaptable across cell types and research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in early-stage research.
- Operational Value: Standardizes 3D culture generation, improving reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and capital efficiency by minimizing experimental variability.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of candidates with robust in vitro data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in 3D cell culture and handling of primary or engineered cell types.
- Needs access to custom stamp devices, agarose molds, and standard cell culture infrastructure.
- Demands cross-team standardization of cell seeding, microwell preparation, and monitoring protocols.
- Adaptable to various cell sources, but optimization may be needed for different tissue types.
- Limitations include potential adaptation for specific cell lines and throughput constraints based on plate format.
