Tijdopgeloste fluorescentie-anisotropie van afzonderlijke moleculen voor het karakteriseren van lokale flexibiliteit in biomoleculen

Dit onderzoek heeft tot doel de lokale flexibiliteit en dynamiek van biomoleculen op het niveau van één molecuul te bestuderen, met behulp van tijdopgeloste fluorescentie-anisotropie in confocale microscopiemodus. Detectie en lokalisatie van afzonderlijke moleculen hebben de observatie van biomoleculen mogelijk gemaakt, maar het vastleggen van hun dynamiek vereist andere benaderingen. Tijdopgeloste fluorescentiemethoden helpen die leemte op te vullen.

Gemeenschappelijke hulpmiddelen voor het experimenteel bestuderen van biomoleculaire dynamica, waaronder single molecule fret en NMR. Op het niveau van één molecuul, verschillende analyses, processen, de foton door foton fluorescerende emissie, Deze omvatten tijdopgeloste analyse en burst-variantieanalyse.

Het gebruik van meerdere fluoroforen voor smFRET-experimenten kan complexiteiten introduceren in het experimentele ontwerp en bij het maken van monsters van voldoende kwaliteit. Het gebruik van een enkel label en fluorescentie-anisotropie lost een aantal van deze complexiteiten op.

We ontdekten dat de monomere vorm van het forkhead-domein van de menselijke FoxP1 zich gedraagt als een ongeordend eiwit en de vouwende populatie vergroot wanneer het dimeriseert.

[Docent] Filtreer om te beginnen de bereide standaard bufferoplossing door een filter met een poriegrootte van 0,22 micrometer. Filtreer vervolgens de standaardbuffer door een koolstoffilter voor acquisitie van één molecuul. Bereid voor de fluorescerende sondes kleine hoeveelheden van de voorbereide BODIPY Fluorescent Pro voor. Voor kalibratie van de opstelling met polarisatie-oplossing schakelt u eerst de parallelle en loodrechte detectorkanalen in en schakelt u de blauwe laser in. Zorg ervoor dat het laservermogen is ingesteld op 60 microwatt en open het tijdgecorreleerde bedieningspaneel voor het tellen van één foton of de TCSPC-software. Meng vervolgens een microliter 100 nanomolaire Rhodamine 110 met 49 microliter gedestilleerd water. Voeg een druppel dompelvloeistof toe aan de objectieflens van de microscoop. Plaats het dekglas op het microscoopobjectief en zorg ervoor dat de waterdruppel gecentreerd is op de lens. Voeg 50 microliter van de verdunde Rhodamine 110-oplossing toe aan het midden van het dekglas voor kalibratiemetingen. Pas het beeldvlak aan zodat het zich in de oplossing en boven het glasoppervlak bevindt. Zoek met behulp van de scherpstelknop het tweede heldere brandpunt en stel dit in op 1 1/2 slag. Open nu de software in de modus Time-Tagged Time-Resolved en klik op de START-knop. Noteer de telsnelheid gedurende 120 seconden. Voeg voor achtergrondmetingen 50 microliter gedestilleerd water toe aan het midden van het afdekglas en herhaal de acquisitie. Registreer de fotontelling gedurende 300 seconden en sla het bestand op als water.ptu. Voeg voor extra achtergrondmetingen 50 microliter standaardbuffer toe aan het midden van het afdekglas. Registreer de fotontelling gedurende 300 seconden en sla het bestand op als standard_buffer.ptu. Start nu de Burst Integration Fluorescence Lifetime, BIFL, analysesoftware en klik op Bevestig de installatie vanuit het automatische venster. Klik vervolgens op Parameters ophalen uit bestand en klik vervolgens op OK. Als u de te analyseren meting wilt selecteren, klikt u op Gegevenspadmatrix en selecteert u de juiste gegevensset. Laad nu het watermetingsbestand water.ptu voor arrays, zoals Green Scatter, het bestand standard_buffer.ptu voor de groene achtergrond en Rhodamine110.ptu voor Green thick. klik onder de selectieparameters voor één molecuul op Volgende en vervolgens op Aanpassen om een nieuw pop-upvenster te openen. Druk vervolgens op Drempel om de aankomsttijd van het interfoton te wijzigen en kies de gebeurtenistijd van een enkel molecuul voor de gemiddelde aankomsttijd van het interfoton. Klik nu op minimum aantal om het minimum aantal fotonen per enkele molecuulgebeurtenis in te stellen. Sluit vervolgens het pop-upvenster door op Return en OK te klikken. Klik op Color Fit-parameters om de initiële fluorescentielevensduur voor groen en andere kleuren aan te passen met behulp van parameters voor fluorescentieverval. Wijzig, prompt en vertraag waarden door de waarden van en naar aan te passen en sluit het pop-upvenster. Druk ten slotte op Opslaan om de ASCII-bestanden te verwerken en op te slaan in de geselecteerde map. Breng een nacht pre-inoculum van Escherichia coli C41 over in 500 milliliter LB-medium met vooraf toegevoegd antibioticum in een verdunningsverhouding van 1:500. Meet de absorptie van de cultuur op 600 nanometer om de cultuurgroei te volgen. Wanneer de optische dichtheid tussen 0,5 en 0,7 bereikt, voegt u IPTG toe tot een uiteindelijke concentratie van 0,5 millimolair om eiwitexpressie te induceren en incubeert. Centrifugeer de bacteriecellen bij 3.000 g gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius wanneer de cultuur een optische dichtheid van 1,4 tot 1,6 bereikt. Nadat u de supernatant hebt weggegooid, bewaart u de pellet tot gebruik bij min 20 graden Celsius. Voeg vervolgens 50 tot 100 micromolair FoxP1-eiwit toe aan een tienvoudige molaire overmaat van DTT of TCEP en incubeer. Plaats een PD-10 ontziltingskolom in een centrifugebuis van 50 milliliter met behulp van een kolomadapter voor bufferuitwisseling. Voeg vijf milliliter PBS-buffer toe aan de kolom voor evenwicht en centrifugeer deze gedurende twee minuten op 1.000 g. Breng de PD-10-kolom over in een nieuwe buis van 50 milliliter en voeg twee milliliter PBS-buffer toe aan de kolom. Laad nu 500 microliter FoxP1-eiwit in de kolom. Elueer de kolom door gedurende twee minuten bij 1.000 g te centrifugeren om het gezuiverde eiwit op te vangen. Breng het eiwit over in een ultracentrifugaalfilter met een molecuulgewicht van 10 kilodalton. Na het centrifugeren bij 7.500 g gedurende 10 minuten, vang je het geconcentreerde eluaat op. Meet de eiwitconcentratie. Voeg vervolgens BODIPY toe en incubeer twee uur bij vier graden Celsius op een rotator. Herhaal de bufferuitwisseling en eiwitconcentratie. Meet na het bepalen van de eiwitconcentratie de mate van etikettering met behulp van de formule. Voeg 495 microliter ultrapuur water en vijf microliter Tween 20 toe aan een putje van een kamerdia en meng goed. Na een incubatie van 30 minuten bij kamertemperatuur wast u de kamer twee keer voorzichtig met ultrapuur water en droogt u deze af. Om te corrigeren voor achtergrondfluorescentie, voert u metingen uit van een bufferoplossing. Kalibreer de relatieve gevoeligheid van de parallelle en loodrechte detectoren door gegevens te verkrijgen van een snel roterende kleurstof Voor experimenten met fluorescentie-anisotropie met één molecuul op monomeer FoxP1, voeg 100 picomolaire BODIPY gelabelde FoxP1 en 100 nano kies niet-gelabelde FoxP1 toe aan 500 microliter standaardbuffer in een kamerglaasje. Begin met de metingen en controleer in de BIFL-software of het aantal bursts dat binnen 30 seconden wordt geregistreerd, tussen de 60 en 90 ligt. Als het monster meer geconcentreerd is, verdun het dan totdat het aantal barstingen binnen dit bereik valt. Analyseer ten slotte de metingen. De analyse van de fluorescentie-anisotropie met één molecuul onthulde een enkele verdeling die voortkwam uit twee verschillende rotatiecorrelatietijden in het FoxP1 DNA-bindingsdomein, wat wijst op het naast elkaar bestaan van geordende en ongeordende structurele ensembles. Burst-variantieanalyse identificeerde een subset van FoxP1-moleculen die hoge anisotropie en overtollige varianten vertoonden, wat wijst op de aanwezigheid van dynamische conformatieveranderingen. Analyse van de fotonenverdeling maakte onderscheid tussen monomere en dimere FoxP1-toestanden, waarbij verschillende anisotropieverdelingen en wisselkoersen werden getoond. Dimerisatie beïnvloedde lokale en globale bewegingen in FoxP1, waarbij metingen van overmatige variantie duidden op significante anisotrope veranderingen op specifieke cysteïne-gelabelde plaatsen. Dynamische anisotropieanalyse toonde aan dat FoxP1 een gedeeltelijke ontvouwing ondergaat bij dimerisatie en DNA-binding, waardoor de fractie van gestructureerde en ongeordende populaties verandert.