De isolatie en karakterisering van neutrofielen met een lage en normale dichtheid uit volbloed

Ons onderzoek heeft tot doel de rol van subgroepen van neutrofielen te begrijpen en hoe ze bijdragen aan de pathogenese van ontstekingsziekten zoals lupus. In bredere zin toont ons werk ook de heterogeniteit van neutrofielenpopulaties in de menselijke biologie aan en hoe dit kan veranderen op basis van verschillende fysiologische toestanden. Opkomend onderzoek toont aan dat neutrofielenpopulaties bij mensen heterogeen zijn.

Neutrofielen worden echter nog steeds bestudeerd als een enkele populatie vanwege de moeilijkheid om subtypes betrouwbaar te isoleren zonder activering en in voldoende hoeveelheid. Ons protocol biedt een methode voor ongerepte isolatie en basiskarakterisering van neutrofielensubtypes, waardoor deze problemen worden overwonnen. Recent onderzoek, hoewel beperkt, heeft aangetoond dat neutrofiele subtypes, zoals neutrofielen met een lage dichtheid, een rol spelen bij veranderde fysiologische toestanden zoals zwangerschap en ontsteking, evenals bij ziekten zoals tuberculose, auto-immuniteit en kanker.

Ons protocol zal reproduceerbaar, robuust onderzoek mogelijk maken naar de bijdragen van deze cellen aan de gezondheid en ziekte van de mens. Nu we een getest robuust protocol hebben voor het scheiden van neutrofielen met een lage dichtheid van neutrofielen met een normale dichtheid, richten we ons op het beantwoorden van basisvragen met betrekking tot hoe deze neutrofielen met een lage dichtheid zich presenteren in ontstekingsaandoeningen. We zijn vooral geïnteresseerd in hoe deze verschillen van neutrofielen met normale dichtheid in hun celaantal, immunofenotype, immunometabolisme en meer.

Label om te beginnen vier conische buizen van 50 milliliter voor isotone werkoplossingen van 100% 81% 70% en 55% Voeg 27 milliliter dichtheidsgradiëntmedium toe aan de eerste buis met het label 100% Voeg 3 milliliter 10X PBS toe. Meet vervolgens de vereiste volumes isotone 100% werkoplossingen en 1X PBS af voor elke concentratie van de werkoplossingen. Voeg het toe aan de respectievelijke conische buizen.

Gebruik een pasteurpipet om grondig te mengen voor homogeniteit. Leg nu voorzichtig 3 milliliter van de isotone 81%-werkoplossing op de bodem van een conische buis van 15 milliliter. Leg er vervolgens langzaam en voorzichtig 3 milliliter van de isotone 70%-werkoplossing op en zorg ervoor dat de lagen niet vermengen.

Om de celscheidingsbuffer voor te bereiden, combineert u 2% foetaal runderserum, 1 millimol EDTA en PBS tot een totaal volume van 500 milliliter. Pipet om grondig te mengen voor uniformiteit. Draai de magnetische kralen gedurende 30 seconden grondig om ervoor te zorgen dat ze volledig opnieuw zijn gesuspendeerd voor gebruik.

Verdeel voor elke donor 4 milliliter volbloed in drie afzonderlijke buisjes met ronde bodem van 14 milliliter. Pipetteer 200 microliter neutrofielenisolatiecocktail en 200 microliter magnetische kralen in elke buis. Piket de oplossing voorzichtig om het mengsel opnieuw te suspenderen voordat u gaat broeden, zodat de reagentia zich kunnen binden aan ongewenste cellen.

Voeg vervolgens de celscheidingsbuffer toe aan elke buis om het volume op 12 milliliter te brengen en meng goed. Plaats de buisjes zonder deksel op een magnetisch rek en broed uit. Gebruik nu een serologische pipet om de clear cell suspensie met neutrofielen voorzichtig uit elk buisje over te brengen in een nieuwe, schone buis.

Verwijder vervolgens de originele buis van de magneet. Draai de magnetische kralen opnieuw gedurende 30 seconden. Voeg 200 microliter van de magnetische kralen toe aan de nieuw overgedragen celsuspensie vóór resuspensie en incubatie, zoals eerder aangetoond.

Plaats de buisjes terug op de magneet zonder deksel. Na een incubatie van 10 minuten bij kamertemperatuur brengt u de clear cell-suspensie met geïsoleerde neutrofielen over in een nieuw buisje. Trek de geïsoleerde neutrofiele suspensies verkregen uit volbloed in een enkele buis van 50 milliliter.

Vul de buis bij tot een totaal volume van 50 milliliter met behulp van de celscheidingsbuffer. Centrifugeer met de rem aan, gooi dan het bovenstaande weg en suspendeer de neutrofielenpellet in 1 milliliter celscheidingsbuffer. Nadat u de suspensie opnieuw hebt gecentrifugeerd, gooit u het bovenstaande weg en resuspenseert u de neutrofielenpellet in 3 milliliter van het 55%dichtheidsgradiëntmedium.

Breng de 3 milliliter 55%density gradient medium met de celsuspensie langzaam aan op de vooraf gemaakte dichtheidsgradiëntbuizen, om verstoring van de gradiënt te voorkomen. Centrifugeer de buisjes op 720 G gedurende 30 minuten zonder de pauze te gebruiken. Behandel de buizen na het centrifugeren voorzichtig om te voorkomen dat de lagen worden verstoord.

Isoleer met een transferpipet zorgvuldig de afzonderlijke lagen met neutrofielen met een lage en normale dichtheid en breng ze over in afzonderlijk gelabelde buisjes van 15 milliliter. Om eventueel resterend dichtheidsgradiëntmedium af te wassen, voegt u PBS toe aan elke buis van 15 milliliter tot de 15 milliliter. Centrifugeer vervolgens 5 minuten bij 400 G bij kamertemperatuur met de pauze aan.

Tel de cellen in elke fractie op een hemocytometer voordat u verder experimenteert. De gelaagdheid van het totale aantal neutrofielen over het dichtheidsgradiëntmedium resulteerde in de succesvolle vorming van twee verschillende banden. Met de neutrofielen met lage dichtheid die een bovenste band vormen en de neutrofielen met normale dichtheid die een onderste band vormen.

Overbelasting van het dichtheidsgradiëntmedium met neutrofielen van meer dan 5-6 miljoen cellen per milliliter zorgde ervoor dat de banden diffuus leken, waardoor het risico op vermenging van het subtype toenam. De gemiddelde isolatiezuiverheid was 93,8% voor neutrofielen met een lage dichtheid en 96,3% voor neutrofielen met een normale dichtheid met minimale besmetting door andere celtypen.