Directe injectie van de nervus vagus voor ratten

We voeren preklinische studies uit naar genvervangingstherapie. We gebruiken proefdieren om de optimale methode van medicijnafgifte vast te stellen om problemen met het autonome en perifere zenuwstelsel aan te pakken. Vectorgebaseerde genvervangingstherapie is een van de opkomende technologieën in gentherapie. De toepassing van adino-geassocieerde virale vector is een van de mogelijke opties die nu beschikbaar zijn. AAV9 wordt veel gebruikt in onderzoek naar gentherapie om het gen van belang in het centrale en perifere zenuwstelsel af te leveren. Onderzoekers hebben niet genoeg opties beschikbaar om geneesmiddelen rechtstreeks in het perifere zenuwstelsel af te leveren. Er zijn situaties waarbij sprake is van neurologische aandoeningen veroorzaakt door het perifere of autonome zenuwstelsel. Er is echter een gebrek aan een effectieve methode voor medicijnafgifte om die situaties aan te pakken.

Deze methode demonstreert een manier om de geneesmiddelen rechtstreeks in de nervus vagus af te leveren om het probleem van het autonome zenuwstelsel aan te pakken in preklinische studies met ratten. Bovendien kan deze methode worden geëxporteerd om medicijnen af te leveren via andere perifere zenuwen met de nodige aanpassingen in andere soorten. Het grijze lab zal AV-gemedieerd preklinisch gentherapieonderzoek voortzetten met zowel knaagdieren als grote dieren. Daarnaast waren we gericht op het ontwikkelen van nieuwe methoden die toepasbaar zijn om de strategie van genvervangingstherapie te effenen.

[Verteller] Sluit om te beginnen een glazen spuit van 100 microliter met de zuiger verwijderd aan op een naald van 27 gauge. Sluit het ene uiteinde van ongeveer 45 centimeter gesteriliseerde polyethyleenslang aan op de naald van 27 gauge, plaats vervolgens een plastic spuit van drie milliliter met een naald van 27 gauge en vul de spuit met ongeveer 0.5 milliliter 0.9% normale zoutoplossing. Gebruik de 0,9% normale zoutoplossing om de polyethyleenslang vanaf het open uiteinde te vullen, zorg ervoor dat de volledige lengte van de slang en de cilinder van de glazen spuit worden gevuld totdat de zoutoplossing overloopt. Als u klaar bent, verwijdert u de spuit van drie milliliter en de naald en gooit u deze weg. Steek nu de zuiger in de cilinder van de glazen spuit en duw deze iets naar voren naar het midden van de cilinder en plaats de glazen spuit in de spuitpomp. Gebruik de spuitpomp om de zuiger iets naar achteren te trekken, waardoor er een luchtruimte van ongeveer 1,5 centimeter ontstaat aan het open uiteinde van de slang. Pipetteer ten minste vijf microliter kleurstof en een kandidaat-medicijnmengsel met behulp van een micropipet van 10 microliter op een gesteriliseerd stuk parafilm. Zuig het kandidaat-medicijnmengsel met behulp van de spuitpomp op in de slang en markeer het niveau van het injectiemengsel met een marker. Plaats een naald van 35 gauge op de slang en bevestig deze met tape op een schoon oppervlak op de chirurgische fase, zodat deze gefixeerd en gesteriliseerd blijft en niets anders aanraakt. Laat de spuitpomp 10 tot 15 seconden aanzetten totdat de injectieoplossing uit de punt van de naald begint te komen. Breng de verdoofde rat over naar een tafel die is uitgerust voor ontharing en voorbereiding van de plaats. Breng kunstmatige scheurzalf aan in beide ogen van de rat om overmatige uitdroging te voorkomen. Dien pijnstillers toe volgens het goedgekeurde institutionele dierprotocol om pijn onder controle te houden wanneer de rat weer bij bewustzijn komt. Scheer de ventrale kant van de nek in het cervicale gebied en verleng deze tot ongeveer twee centimeter loodrecht vanaf de middellijn aan beide zijden van de kin tot het borstbeen. Het geschoren gebied drie keer gesteriliseerd met 70% ethylalcohol en 10% Betadine, naar buiten vegend in een cirkelvormig patroon. Breng de rat in rugligging onder de snijmicroscoop over naar de chirurgische fase. Zorg ervoor dat het verwarmingskussen onder de rat op de juiste manier wordt getemperd en pas de microscopen aan om het cervicale gebied voor een operatie zichtbaar te maken. Haak de ratten of kaaktanden vast met een niet-resorbeerbare hechtdraad. Bevestig het open uiteinde van de hechting in de neuskegel om de neusgaten tijdens de anesthesie in de neuskegel te houden. Plaats de rat zo dat zijn kop aan de linkerkant van de rechtshandige chirurg ligt. Plaats een gesteriliseerd gaaskussen onder de nek om uit te lijnen en maak het cervicale gebied recht. Bedek het lichaam van de rat met een gesteriliseerd laken en laat het operatiegebied bloot. Bevestig vier oprolpennen met magnetische fixatoren op de vier hoeken van de chirurgische fase. Injecteer nu lokale anesthetica epidermaal op de middellijn van het cervicale gebied waar de incisie zal worden gemaakt. Gebruik een scalpelmes om een longitudinale incisie in de huid te maken op de middellijn tussen de kin en het borstbeen in het ventrale cervicale gebied. Vervolgens scheidt stomp met gesteriliseerde katoenen tips de gesneden huidranden. Trek met behulp van de oprolpunten de gescheiden huidranden in tegengestelde richting in. Scheid de fascia met wattenstaafjes om dieper te gaan en duw de speekselklieren zijwaarts. Scheid nu de borstbeenmastoïdspieren met wattenstaafjes en trek ze zijdelings in met oprolpennen. Ga door met het scheiden van weefsel aan de linkerkant van de luchtpijp totdat de halsslagaderschede zichtbaar is. Gebruik een fijne tang om een klein gaatje in de halsslagader te maken zonder de halsslagader te beschadigen, en scheid voorzichtig de linker nervus vagus van de gemeenschappelijke halsslagader. Zodra de zenuw met een tang van de slagader is gescheiden, gebruikt u een gebogen naald van 25 gauge die op een spuit van één milliliter is bevestigd om te haken en houdt u de zenuw vast met de niet-dominante hand. Houd de naald met het kandidaat-kleurstofmengsel met de dominante hand vast. Om een vlotte prik te vergemakkelijken, houdt u de zenuw recht door er voorzichtig aan te trekken met de 25 gauge haak. Steek de naald in de zenuw en schuif deze meer dan 0,5 centimeter naar voren terwijl u de naald evenwijdig aan de nervus vagus houdt. Trek iets naar achteren zodat er ongeveer 0,4 tot 0,5 centimeter van de naald in de zenuw blijft. Beperk het aantal zenuwprikken met een enkele naald tot niet meer dan drie keer. Nadat u het inbrengen van de naald hebt bevestigd, behoudt u zijn positie zonder te bewegen en zet u de spuitpomp aan. Controleer de infusie om er zeker van te zijn dat deze in de zenuw blijft en soepel stroomt. Gebruik de gemarkeerde punt op de infuusslang om de beweging van het kleurstofmengsel te volgen. Observeer hoe de zenuw de kleur van de kleurstof begint te ontwikkelen. Verwijder de gebogen naald van 25 gauge en beweeg de tissues met steriele wattenstaafjes voorzichtig terug naar hun oorspronkelijke positie. Verwijder vervolgens de oprolpunten. Sluit de wond met een resorbeerbare of niet-resorbeerbare hechting en breng indien nodig een kleine hoeveelheid weefsellijm aan tussen de hechtingen om ervoor te zorgen dat de wond perfect sluit.