Nieuwe en efficiënte methode voor Drosophila-hartfluorescentiekleuring met cryosectie

Mijn onderzoekslab gebruikt het drosophila-model om veroudering en metabole stoornissen te bestuderen, waarbij tijdsbeperkt voeden en oefening worden onderzocht als interventie voor metabolische, hartspier-, slaap- en andere verouderingsziekten. Machine learning en omic met fysiologische genetische en voedingsstrategieën stroomlijnt de drosophila-test met behulp van 3D-geprinte apparaten en machine learning-benaderingen. Fluorescerende immunohistologie van drosophila-harten maakt multi-proteïne detectie mogelijk over genotypen en leeftijden, maar staat voor uitdagingen zoals complexe dissecties, weefselbehoud en hoge-resolutie beeldvorming van specifieke eiwitexpressiepatronen.

Dit protocol verbetert weefselbehoud, antilichaampenetratie en beeldresolutie, waardoor betere visualisaties van cardiale proteïnemarkers mogelijk worden. Het lost uitdagingen op zoals complexe dissectie, weefselschade en beperkte resolutie in traditionele volledige hartmontagemethoden. Dit protocol verbetert de toegankelijkheid van drosophila-hartonderzoek door complexe dissectie te elimineren, eenhandige uitvoering mogelijk te maken en dure confocale microscopie te vermijden, waardoor hoge-resolutie beeldvorming haalbaarder wordt.

Om te beginnen, verdooft u 5 tot 10 vliegen met behulp van een kooldioxide vliegmat. Positioneer de vliegen binnen het zicht onder de microscoop met 1X tot 2X vergroting. Gebruik verenschaar om de vliegen te onthoofden, de vleugels af te knippen en de poten te verwijderen.

Houd de borst en buik samen, aangeduid als het lichaam. Gebruik een borstel om de lichamen voorzichtig in gelabelde 1,5-milliliterbuisjes op ijs te plaatsen totdat alle experimentele groepen zijn verzameld. Nadat de buisjes uit het ijs zijn verwijderd, voegt u 100 microliters van 10-millimolair ethyleenglycoltetraazijnzuur op pH 8 toe aan elke buis.

Zorg ervoor dat alle lichamen ondergedompeld zijn en plaats de buisjes 10 minuten op een orbitale schudder. Vervolgens verwijdert u de ethyleenglycoltetraazijnzuuroplossing uit de buisjes. Pipetteer 100 microliters PBS in elke buis om het weefsel 10 minuten te wassen.

Plaats de buisjes op de orbitale schudder tijdens het wasproces. Na het weggooien van de PBS, pipetteer 100 microliters van 4% paraformaldehyde in PBS-oplossing in elke buis. Plaats de buisjes 15 minuten op een orbitale schudder bij 100 eenheden, waarbij u ervoor zorgt dat de weefsels in contact blijven met de oplossing.

Gooi vervolgens de paraformaldehyde-oplossing weg. Zodra de laatste wasbeurt voltooid is, brengt u de lichamen over in een oplossing van 10% sucrose in PBS. Zorg ervoor dat de lichamen in contact zijn met de oplossing in de buis.

Haal droog ijs uit de opslag en selecteer een paar stukken voor plaatsing in een kleine metalen of plastic lade. Kies een lade met afmetingen die het gietstelsel toelaten om te worden ingebracht en plaats het direct bovenop een enkele grote en platte plak droog ijs. Vul een gelabeld gietstelsel tot 50% met optimale snijdtemperatuur, of OCT-compound, en giet langzaam om luchtbellen te minimaliseren.

Plaats met een borstel de ontlede en gefixeerde drosophila-lichamen voorzichtig op het oppervlak van de OCT-compound in het gietstelsel. Gebruik een pincet om elk lichaam naar de bodem van het gietstelsel te duwen met de dorsale wand van de borst en buik over het algemeen uitgelijnd langs de bodem. Pas de lichamen aan zodat de buik plat langs de bodem van het gietstelsel ligt.

Lign de lichamen in de X-, Y- en Z-dimensies om ervoor te zorgen dat elke sectie alle onderwerpen tegelijkertijd zal bevatten. Corrigeer de kromming van de buik, vooral bij mannen, om deze zoveel mogelijk te vlakken zonder de lichamen te puncteren of te verpletteren. Zodra alle onderwerpen op hun plaats zijn, plaats u het gietstelsel zodat de bodem direct op een stuk droog ijs ligt.

Zorg ervoor dat de OCT-compound begint te bevriezen bij contact en ga door totdat alle onderwerpen volledig in het gietstelsel zijn ingesloten. Na het bevriezen, brengt u het gietstelsel over naar een vriezer ingesteld op min 20 graden Celsius om volledig bevriezing mogelijk te maken. Zodra volledig bevroren, vult u het resterende deel van het gietstelsel met OCT-compound.

Om een koppelstukbit aan het gietstelsel te bevestigen, brengt u een royale hoeveelheid OCT-compound aan op de blok. Druk het bit plat op de compound en laat het volledig bevriezen in de cryostat, meestal binnen vijf minuten. Laat vervolgens het koppelstukbit en het OCT-blok los van het gietstelsel.

Plaats het bit in het koppelstuk en zorg ervoor dat de blok van boven naar beneden goed is gepositioneerd en draai de koppelstuksleutel vast om het bit te bevestigen. Gebruik nu de aanpassingsknoppen en koppelstukdieptebedieningen om de blok met het mes uit te lijnen en stel de sectiebreedte in op 20 micrometer of lager. Snijd elke plak uit de blok met behulp van een langzame maar constante beweging, waardoor het anti-rolglas elke plak kan vangen terwijl deze wordt gesneden.

Verzamel de secties met behulp van verwarmde dia's. Verwijder met een scheermesje het overtollige OCT-compound rond de secties. Omlijn de rand van elke dia met een hydrofobe stift om was- en kleuroplossingen beperkt te houden tot het weefsel.

Gebruik een 1000-microliter pipet om de dia's drie keer te wassen met PBS gedurende vijf minuten elk zonder het weefsel aan te raken. Na het weggegooien van de laatste wasbeurt, pipet de fluorescente kleurstofoplossing op de weefsels en incubeer een uur bij kamertemperatuur in het donker. Gooi vervolgens de fluorescente kleurstof weg en was de dia's drie keer vijf minuten met PBS.

Verwijder daarna de laatste PBS-was en laat een kleine hoeveelheid oplossing op de dia. Gebruik een 1000-microliter pipet om drie tot vijf druppels montagemedium op de dia te pipetten, vermi