Ontwikkeling en beoordeling van intracellulaire infectiemodellen voor Staphylococcus aureus

Ons onderzoek richt zich op Staphylococcus aureus-infecties met als doel een intercellulair infectiemodel op te zetten. Dit model zal waardevolle inzichten verschaffen in het mechanisme dat ten grondslag ligt aan intercellulaire infecties en bijdragen aan de ontwikkeling van strikte leeftijd voor hun preventie en behandeling. De nieuwste vooruitgang bij intracellulaire infectie van Staphylococcus aureus is het bestuderen van het infectiemechanisme om de overleving en de verspreiding van bacteriën in de cel te reguleren, en zal bijdragen aan het optimaliseren van het medicijn en de structurele modificatie om meer therapeutisch effect te verbeteren.

Dit onderzoeksgebied maakt gebruik van celcultuur, celopkomende sequencingtechnologie, high-fuel oxytherms, genbewerkingstechnologie en andere gerelateerde technologieën om bacterie-infectie in cellen te bestuderen. In tegenstelling tot traditionele infectiemodellen hebben we de experimentele omstandigheden die specifiek zijn voor intracellulaire infecties verfijnd. Na het individueel infecteren van cellen met Staphylococcus aureus, worden de met bacteriën geïnfecteerde cellen vervolgens geïnoculeerd in muizen om intracellulaire infecties te veroorzaken.

Deze aanpak verbetert de efficiëntie door de interferentie van de vrije bacteriën te minimaliseren, wat zorgt voor een nauwkeurigere retentie van het intracellulaire infectieproces. Onze methode zal zich richten op het ontwikkelen van antilichaamgeneesmiddelen en vooruitgang boeken om bacteriële infecties in de toekomst te voorkomen en te behandelen. Om een zetmeelbouillon van 6% te bereiden, voegt u rundvleesextractpoeder, trypton en natriumchloride toe aan een glazen container, achtereenvolgens in een massaverhouding van 3 tot 10 tot 5.

Voeg 100 milliliter dubbel gedestilleerd water toe en roer om de componenten op te lossen. Verwarm de oplossing in de magnetron. Voeg vervolgens oplosbaar zetmeel toe in een massaverhouding van 6 en roer het mengsel tot het volledig is opgelost.

Autoclaaf de bouillon gedurende 30 minuten op 121 graden Celsius. Eenmaal gesteriliseerd, bewaar je de bouillon bij vier graden Celsius tot er een pasta ontstaat. Om peritoneale macrofagen van de muis te verzamelen, pakt u met de linkerhand de nek van de muis vast en controleert u zijn staart.

Draai vervolgens de muis om zodat de kop naar beneden ligt en de buik naar boven. Dien een intraperitoneale injectie van drie milliliter 6% zetmeelbouillon toe aan de muis. Offer na 72 uur injectie de verdoofde muis en desinfecteer deze met 75% ethylalcohol.

Knip met een oogheelkundige schaar de buik van de muis open om het buikvlies volledig bloot te leggen. Injecteer 10 milliliter DMEM in de buikholte door middel van intraperitoneale injectie. Wrijf een minuut zachtjes over de buik om de holte te spoelen.

Gebruik vervolgens een spuit om de gespoelde vloeistof op te vangen in een centrifugebuis van 50 milliliter. Centrifugeer de spoelvloeistof gedurende vijf minuten bij 300 G en gooi de supernatant weg. Resuspendeer de celpellet in 10 milliliter DMEM aangevuld met 10%FBS, penicilline en streptomycine.

Neem 10 microliter celsuspensie en voeg deze toe aan de cellenteller om de cellen te tellen. Verdun de cellen tot een concentratie van 2 keer 10 tot de macht van 6 cellen per milliliter met DMEM FBS. Plaat een milliliter celsuspensie per putje op een plaat met zes putjes.

Incubeer de plaat vier uur lang bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide. Verwijder na de incubatie de supernatant. Was de cellen twee keer met steriel PBS en kweek ze een nacht met één milliliter DMEM per putje onder dezelfde omstandigheden.

Incubeer de peritoneale macrofagen met staphylococcus aureus MRSA-252 gedurende twee uur. Verwijder het bovenstaande en was de cellen twee keer met PBS. Voeg per putje één milliliter compleet DMEM-medium toe dat 100 microgram per milliliter gentamicine bevat en incubeer gedurende twee uur bij 37 graden Celsius in 5% koolstofdioxide.

Was de cellen na incubatie driemaal met PBS. Verzamel met behulp van een celschraper de peritoneale macrofagen in centrifugebuisjes van 50 milliliter. Centrifugeer de monsters gedurende vijf minuten bij 1000 G.

Voeg 10 microgram per milliliter lysozym toe aan de macrofagen die zijn geïnfecteerd met intracellulair MRSA-252 en incubeer gedurende 10 minuten bij 37 graden Celsius. Nadat u de cellen twee keer met PBS hebt gewassen, suspendeert u ze opnieuw in een milliliter PBS. Haal vervolgens ongeveer 20 microliter aliquot eruit en voeg gedurende vijf minuten 0,1% Triton X-100 toe om de cellen te lyseren.

Voer seriële verdunningen uit van de gelyseerde celsuspensie met PBS en laat ze op een tryptische soja-vijzelplaat vallen. Incubeer de plaat een nacht bij 37 graden Celsius. Tel de volgende dag de bacteriekolonies om de intracellulaire MRSA-252-bacteriën in peritoneale macrofagen te berekenen.

Plaats de muis onder een infrarood fysiotherapielamp totdat de staartader verwijd is. Verdeel de muizen willekeurig in vier groepen. Injecteer intraveneus 3 keer 10 tot de kracht van 6 CFU planktonisch MRSA-252 in de staartader van de muis.

Offer na 24 uur de verdoofde muis en desinfecteer deze grondig met 75%ethylalcohol. Gebruik een pincet met één hand om de buikhuid op te tillen en knip met de andere hand de huid af met een oogheelkundige schaar. Zoek de nieren in de buikholte en strip ze voorzichtig volledig.

Breng de nieren over in een maalbuis met één milliliter PBS en maal ze totdat er geen vast weefsel meer over is. Giet het gehomogeniseerde weefsel in de Eppendorf-buis. Voer seriële verdunningen van het weefselhomogenaat uit met behulp van PBS.

Spot elke verdunning op afzonderlijke drieluik soja-vijzelplaten en broed ze een nacht uit bij 37 graden Celsius. Tel de bacteriekolonies de volgende dag en analyseer de gegevens. Intracellulaire infectiemodellen van S.aureus werden met succes opgesteld onder geoptimaliseerde fagocytoseomstandigheden en uitgebreide antibioticabehandeling, waarbij sommige bacteriën in macrofagen overleefden.

Macrofagen geïnfecteerd met methicilline-resistente S.aureus behielden intracellulaire bacteriën na twee uur antibioticabehandeling toen het bovenstaande geen bacteriën meer bevatte. In vivo toonden bacteriële kolonisatietesten bij muizen aan dat vancomycine extracellulaire S.aureus elimineerde, maar er niet in slaagde intracellulaire bacteriën te verwijderen.