Oncogene expressieanalyse met veranderingen in pH in een ductale cellijn van de pancreas

In AIG-ziekenhuizen onderzoeken we hoe verminderde ductale secretie van de pancreas en verlaagde pH de genexpressies in de ductale cellen van de pancreas beïnvloeden, met name gericht op de oncogenen, waarbij we de mogelijkheid van cellulaire aanpassing aan zure micro-omgevingen onderzoeken. De uitdaging hier is de heterogeniteit van pancreastumoren, wat zowel de behandeling als de experimentele benaderingen bemoeilijkt. Dus voerden we RNAC-analyse uit van ductale cellen van de pancreas onder verlaagde pH-omstandigheden, en we ontdekten dat er een verhoogde expressie is van drie oncogenen, wat de mogelijke verbanden tussen de zure omgeving en de expressie van het oncogen in ductale cellen van de pancreas benadrukt.

Onze studie heeft licht geworpen op de oncogenexpressie onder verlaagde pH-omstandigheden, en dit systeem kan ons onderzoek bevorderen bij het bestuderen van ductaal adenocarcinoom van de pancreas onder omstandigheden van ontsteking. De toekomstige reikwijdte van deze studie is dus het evalueren van de rol van verhoogde oncogenexpressies bij het initiëren van tumoren onder ontstekingsaandoeningen, zoals bij chronische pancreatitis. Schaf om te beginnen de menselijke normale ductale cellijn van de alvleesklier aan.

Ontdooi de cellen bij 37 graden Celsius in een waterbad. Filtreer nu vers bereid compleet medium door een spuitfilter. Voeg zes milliliter compleet medium toe aan een nieuwe conische buis van 15 milliliter.

Breng vervolgens de ontdooide celsuspensie over in de buis en meng grondig. Centrifugeer de suspensie gedurende zes minuten bij 1.800 G. Gooi het bovenstaande weg en voeg een milliliter kweekmedium toe aan de pellet voordat u voorzichtig mengt.

Voeg vervolgens vier milliliter compleet medium toe aan een petrischaaltje van 60 millimeter. Pipetteer vervolgens de celsuspensie druppelsgewijs in de kolf. Incubeer de cultuur bij 37 graden Celsius onder 5% kooldioxidesuppletie.

Om de pH van het kweekmedium te veranderen, bereidt u eerst 100 milliliter 0,5 molaire natriumfosfaatbuffervoorraadoplossingen met pH-waarden van 6,0, 6,5 en 7,0. Controleer de pH met een pH-meter en pas deze aan met één molair zoutzuur of één molair natriumhydroxide. Filtreer vervolgens, steriliseer de buffers in een laminaire luchtstroomkap met behulp van een spuitfilter van 0,45 micrometer.

Voeg vervolgens 20 milliliter steriele 0,5 molaire natriumfosfaatbuffer van de respectieve pH toe aan 80 milliliter kweekmedium om media met verschillende pH te bereiden. Voeg de media met de gewijzigde pH toe aan 85 tot 90% confluente menselijke ductale pancreascellen. Observeer morfologische veranderingen onder een helderveldmicroscoop met tussenpozen van een uur gedurende zes uur.

Om RNA uit de cultuur te isoleren, aspireert u eerst het kweekmedium op en spoelt u de cellen met één milliliter PBS. Plaats de 60 millimeter schaal op ijs, vervolgens een milliliter PBS op de 60 millimeter schaal en schraap de cellen met een celschraper. Breng nu de suspensie over in een nieuwe buis.

Centrifugeer het gedurende 10 minuten op 8.000 G en gooi het bovenstaande weg. Voeg vervolgens 600 microliter lysisbuffer met bèta-mercaptoethanol toe aan de pellet. Pipetteer de suspensie vijf tot 10 minuten op en neer op ijs.

Voeg een gelijk volume van 70% ethanol toe aan het lysaat en pipetteer de suspensie om grondig te mengen. Breng de oplossing over naar een silicamembraankolom. Centrifugeer vervolgens de kolom op meer dan 8.000 G gedurende 30 seconden en gooi de stroom erdoor.

Voeg vervolgens 500 microliter wasbuffer toe aan het monster en centrifugeer opnieuw. Centrifugeer de lege buis gedurende een minuut op meer dan 8.000 G.Voeg ten slotte 30 tot 50 microliter nucleasevrij water toe aan de kolom. Na een incubatie van vijf minuten bij kamertemperatuur centrifugeert u de kolom opnieuw met snelheden hoger dan 8.000 G gedurende vijf minuten.

Er werd een significante vermindering van de celgrootte en krimp van ductiele cellen in een zuur medium waargenomen in vergelijking met cellen die in een normaal medium werden bewaard. De meest uitgesproken veranderingen in celdood traden op na zes uur incubatie, met een verdere afname van het aantal cellen en tekenen van cellulaire stress na 22 uur. Het aantal opgereguleerde genen was het hoogst bij pH 6,5 met 148 genen, gevolgd door pH zeven met 109 genen en pH zes met 90 genen.

Gedownreguleerde genen waren minder met 20 bij pH zes, 14 bij pH 6,5 en 23 bij pH zeven. Drie oncogen, LCK, FGR en ASAP drie werden opgereguleerd over alle geteste pH-waarden, wat wijst op een rol bij celproliferatie onder zure omstandigheden.