3D generatie van menselijk myocardweefsel met behulp van smeltelektrospinning schrijven van polycaprolactonsteigers en hiPSC-afgeleide hartcellen

Deze studie heeft tot doel biometrisch 3D-hartweefsel te ontwikkelen met behulp van gesmolten elektrische steigers en menselijke iPSC-afgeleide hartcellen om ziektemodellering, medicijntesten en toepassingen in regeneratieve geneeskunde te verbeteren. Door de mens geïnduceerde rapportage in stamcelcardiomyocyten blijft onvolgroeid, waardoor hun functionaliteit wordt beperkt. Bovendien is het een uitdaging om de ernstige complexiteit te reproduceren die nodig is om hartweefsel in 3D te modelleren.

Dit model bootst het natuurlijke myocardium beter na, waardoor complexe 3D-extracellulaire matrixinteracties mogelijk zijn voor ziektemodellering, medicijntesten en patiëntspecifieke toepassingen. Het biedt een relevanter alternatief voor 2D-culturen en diermodellen. In de toekomst zal ons onderzoek zich richten op het onderzoeken van cardiomycologische modellen, het verbeteren van 3D-weefselrijpingsprotocollen en het ontwikkelen van grotere constructen voor preklinische myocardinfarcttherapieën in grote diermodellen zoals varkens.

Sluit om te beginnen de spuit aan op een stikstoftoevoerleiding onder druk en breng deze in de verwarmingskamer. Zet de smelt-elektrospinning-schrijfapparatuur aan en stel de temperatuurregelaars in op 80 graden Celsius voor de kamer en 65 graden Celsius voor het mondstuk. Verplaats na 30 minuten de verzamelplaat totdat de printkop zich aan een rand van de plaat of op een andere gewenste locatie bevindt.

Stel de afstand tussen de verwarmingskamer en de collectorplaat handmatig in op 10 millimeter in het z-vlak. Sluit de deur van de apparatuur, die automatisch de elektrische veldvoeding verbindt. Stel de spanning in op zeven kilovolt in stikstofdruk op twee bar voor extrusie door de 23-gauge tip.

Laad de G-code van het ontwerp in de software om steigers te printen met een vierkante patroongeometrie. Stel de opvangbaksnelheid in op 1080 millimeter per minuut. Druk vervolgens op de knop Cyclus starten om het afdrukken te starten.

Nadat het afdrukken is voltooid, verwijdert u de steiger voorzichtig uit de opvangbak. Snijd het bedrukte gaas met behulp van een pons met een diameter van zes millimeter om de uiteindelijke steigers voor weefselfabricage te verkrijgen. Behandel de steigers gedurende vijf minuten met zuurstofplasma.

Steriliseer de mazen door ze 30 minuten onder te dompelen in 70% ethanol. Was ze 30 minuten uitgebreid met steriel gedestilleerd water en laat ze vervolgens drogen. Na het losmaken van de menselijke iPSC-cardiomyocyten, suspendeert u de celpellet opnieuw in het weefselgeneratiemedium en telt u de cellen met behulp van de Neubauer-kamer.

Evenzo, na het losmaken van de menselijke iPSC-cardiale fibroblasten, suspendeert u de celpellet opnieuw in het weefselgeneratiemedium en telt u de cellen. Meng het benodigde totale aantal cellen in een nieuwe tube en verwijs naar de inhoud als Cell Mix. En centrifugeer op 300G gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur.

Susmureer vervolgens het celmengsel opnieuw in het vereiste volume weefselgeneratiemedium. Om Hydrogel Mix te genereren, voegt u het vereiste volume fibrinogeen toe aan de tube bij kamertemperatuur en mengt u voorzichtig. Zaai de Hydrogel Mix op een polytetrafluorethyleen oppervlak om te voorkomen dat fibrine aan de plaat hecht.

Pipetteer de helft van het volume van het weefsel en laat het als een druppel over. Plaats een polycaprolacton, of PCL, steiger op elke druppel en voeg het resterende volume toe aan de steiger. Voeg nu de benodigde hoeveelheid trombine toe en meng snel de hydrogel, vermijd zorgvuldig luchtbellen.

Incubeer de weefsels gedurende een uur bij 37 graden Celsius om de fibrinepolymerisatie te voltooien. Pak elk weefsel voorzichtig bij de rand op met een steriel pincet en breng ze over naar platen met 12 putjes met weefselgeneratiemedium aangevuld met aprotinine. Incubeer de weefsels gedurende 24 uur bij 37 graden Celsius.

Ververs het medium de volgende dag met twee milliliter weefselonderhoudsmedium en verwijder KSR- en Y-27-residuen. Het zaaien van een acht tot twee mengsel van menselijke iPSC-cardiomyocyten en menselijke iPSC-cardiale fibroblasten in fibrinehydrogels resulteert in een uniforme celverdeling over de steigerporiën binnen een uur na polymerisatie. Confocale immunofluorescentiebeelden toonden een gemengde celdistributie van de cellen door het 3D-weefsel dat interageerde met de PCL-steiger, waarbij een meerderheid van de menselijke iPSC-cardiomyocyten gekleurd was voor sarcomere actinine op afstand van elkaar met vimentine-gelabelde menselijke iPSC-cardiale fibroblasten.

Menselijke iPSC-cardiomyocyten vertonen een goed georganiseerde sarcomeerstructuur door sarcomeer actinine-eiwit met regelmatige tussenafstand. Cellen begonnen op dag twee spontaan te kloppen met een gemiddelde slagfrequentie van 30 slagen per minuut op dag zeven, met een gestabiliseerde samentrekking door het hele gaas. In de loop van de tijd werd een geleidelijke afname waargenomen tot 17 BPM op dag 14.

Desondanks bleef de metabole activiteit stabiel tussen dag zeven en dag 14, wat de aanhoudende levensvatbaarheid van de cellen bevestigt. Ten slotte toonde trackpoint-analyse van de kloppende weefsels een contractiesnelheid van 38 micrometer per seconde en een contractieamplitude van 29 micrometer.