High-throughput flowcytometriemeting van cellulair mechanotype op basis van ruptuur en afgifte van DNA-spanningssondes in cellen

Ons laboratorium bestudeert over het algemeen moleculaire mechanismen die cellen gebruiken om mechanische stimuli over te brengen. Onlangs hebben we high-throughput-methoden ontwikkeld om de krachten te meten die cellen op hun omgeving uitoefenen om mechanobiologie in het omics-tijdperk te brengen. Studies impliceren mechanische krachten in hoe T-cellen worden geactiveerd door het juiste antigeen en hoe stamcellen differentiëren tot gespecialiseerde celtypen.

Onlangs hebben targetingprocessen die ten grondslag liggen aan ontregelde celmechanica geleid tot de ontwikkeling van mechanotherapeutica als een manier om ziekten te behandelen. DNA-duplex- en haarspeldsensoren meten extracellulaire krachten, terwijl genetisch gecodeerde sensoren intracellulaire metingen mogelijk maken. Bijna allemaal zijn high-end microscopen nodig.

Tractiekrachtmicroscopie kan de kracht meten die de cellen op hun omgeving uitoefenen, maar het gaat ook om beeldvorming met hoge resolutie. In dit werk gaan we in op drie uitdagingen in het veld, ten eerste met behulp van flowcytometrie voor krachtmeting in plaats van beeldvorming, ten tweede met behulp van HOH-tag-technologie om liganden en antilichamen aan DNA-sondes te bevestigen, en ten derde met behulp van standaard celkweekplaten zonder speciale oppervlaktebehandelingen. Hoe veranderingen van door cellen gegenereerde krachten kunnen worden gebruikt als een prognostische marker voor de ziektetoestand, en dragen deze krachten bij aan, of zijn ze een secundair effect van die ziektetoestand?

Monteer om te beginnen duplexen in een verhouding van 1,1 tot één molaire verhouding van ankerstreng met quencher tot ligandstreng met fluorofoor. Bereid de duplexen voor op een eindconcentratie van 40 micromolaire ligandstrengen in de oplossing. Om de geassembleerde duplexen uit te gloeien, incubeer je ze gedurende vijf minuten bij 98 graden Celsius.

Laat het mengsel vervolgens een uur afkoelen tot kamertemperatuur, weg van licht. Reageer de gegloeide duplexen met HUH met behulp van de concentratie van de minst voorkomende streng uit de gloeistap, in dit geval de ligandstreng. Meng de duplexen met HUH in een verhouding van één tot twee molair bij een eindconcentratie van 10 micromolaire duplex en 20 micromolaire HUH.

Incubeer de reactie gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius in een thermische cycler of een lichtbeschermd warmteblok. Verwijder na de incubatie de reactie van het vuur en gebruik een tafelmodel minicentrifuge om de nu geassembleerde spanningsmeterkettingen of TGT's naar beneden te laten draaien. Wanneer de TGT's voldoende hechten, wast u de putjes met de gewenste cellen drie keer met PBS.

Volg dit met twee wasbeurten met serumvrije media en laat de media na de laatste wasbeurt in de putjes zitten. Voeg 200 microliter PBS toe aan de perifere putten om randeffecten te verminderen. Breng de plaat over naar een broedmachine van 37 graden Celsius om de plaat voor te verwarmen.

Haal vervolgens de cellen op die van belang zijn met ongeveer 80% confluentie. Zuig de media op, was de cellen vervolgens met PBS en incubeer de cellen met trypsine bij 37 graden Celsius totdat de cellen dissociëren, wat ongeveer vijf tot 10 minuten duurt. Zodra de cellen zijn gedissocieerd, voegt u het oorspronkelijke volume van de volledige celmedia toe die zijn gebruikt om de cellen te onderhouden.

Resuspendeer de cellen met behulp van een serologische pipet en breng de celsuspensie over in een conische buis van 15 milliliter. Centrifugeer de cellen gedurende vier minuten bij 300 G. Zuig de media op en suspendeer de pellet opnieuw in PBS.

Na het herhalen van de centrifugatie, suspendeer de cellen in vijf milliliter serumvrije media en centrifugeer opnieuw. Zuig de cellen op en suspendeer ze in ongeveer twee milliliter serumvrije media. Bepaal de dichtheid van de geresuspendeerde cellen om de concentratie naar wens aan te passen.

Als u de effecten van het geneesmiddel test, voegt u optioneel de juiste concentratie van het geneesmiddel toe aan de cellen en plaatst u de cellen terug in de broedmachine voor de pre-incubatietijd voordat u verder gaat. Haal nu de originele plaat uit de broedmachine en verwijder de resterende media die zijn achtergebleven van de was in de experimentele putjes. Was de putjes één keer met het gewenste medium en pipetteer 100 microliter van de geresuspendeerde cellen in de gewenste putjes.

Breng de geplateerde cellen gedurende 90 minuten over naar de broedmachine. Verwijder na de incubatie ongeveer 125 tot 170 microliter volume uit elk putje. Was de cellen indien nodig voorzichtig met 200 microliter opgewarmde PBS.

Incubeer vervolgens de cellen in elk putje met 50 microliter trypsine totdat de cellen beginnen te dissociëren, wat ongeveer vijf tot 10 minuten duurt. Voeg vervolgens 160 microliter vers bereide stroombuffer toe aan elk putje. Pineer voorzichtig op en neer om de cellen te dissociëren.

Breng 196 microliter van deze celsuspensie over in PCR-buisjes, voeg vier microliter propidiumjodide toe en meng voorzichtig. Plaats ten slotte de buisjes in een ijsemmer met een deksel dat licht blokkeert en meet de fluorescentie-intensiteit met behulp van een flowcytometer. Flowcytometrie gating bevestigde succesvolle levende isolatie van afzonderlijke cellen, wat zorgt voor een nauwkeurige mechanotype-analyse.

Een negatieve controlepoort, ingesteld op het 99e percentiel van Cy5-A-fluorescentie, vormde een basislijn voor de vergelijking van experimentele omstandigheden. CHO-K1-cellen behandeld met Y27632 vertoonden een significante afname in het percentage cellen dat de negatieve controlepoort op afschuif-TGT's overschreed, terwijl het uitpakken van TGT's slechts een bescheiden en statistisch onbeduidende afname vertoonde. Het uitpakken van TGT's resulteerde consequent in een hoger percentage cellen dat de negatieve controle overschreed in vergelijking met het afschuiven van TGT's, wat hun lagere krachtvereiste bevestigt.