Karakterisering van pH-afhankelijke omkeerbare zelfassemblage van amyloïde bèta-1-40-gecoate goudcolloïden

De focus van mijn onderzoek is het verkrijgen van de kritische bevestigingsinformatie van amyloïde bèta 1-40 wanneer het wordt geabsorbeerd over het oppervlak van de gouden nanodeeltjes en er een omkeerbaar aggregatieproces plaatsvindt. De uitdaging waar we in dit onderzoeksveld voor staan, is het verkrijgen van thermische, chemische en dynamische informatie over het omgekeerde aggregatieproces. De grote bevinding van dit project is dat we in staat zijn om de specifieke bewegings- of trillingsmodus te identificeren die bijdraagt aan gevouwen of ongevouwen bevestiging van amyloïde bèta 1-40 wanneer ze worden geabsorbeerd over het oppervlak van de gouden nanodeeltjes.

Het grote voordeel van het gebruik van SERS, surface-enhanced Raman scattering spectroscopy, is het detecteren van zeer kleine, zwakke verstrooiingssignalen om de modus te identificeren die cruciaal is om vouwen en ontvouwen te veroorzaken. Tegelijkertijd zijn we in staat om de morfologie van de aggregaten vast te stellen. De bevindingen die we uit dit project kunnen halen, zijn de belangrijkste interactie van eiwit-eiwitinteractie, die belangrijk zal zijn voor het veroorzaken van de oligomeer en die zal leiden tot de fibrogenese.

Voeg om te beginnen met behulp van een micropipet een milliliter gedestilleerd gedeïoniseerd water toe aan een milligram gevriesdroogd amyloïde bèta, of A bèta 1-40. Meng de oplossing met een vortexmixer gedurende ongeveer 30 seconden. Zorg ervoor dat er geen vaste deeltjes in de oplossing achterblijven bij kamertemperatuur, ongeveer 20 graden Celsius.

Bereid vervolgens peptidevoorraadoplossingen met behulp van gedeïoniseerd en gedestilleerd water. Bepaal de peptideconcentratie door spectroscopisch de absorptie van tyrosine te meten bij 275 nanometer. Bewaar de A beta 1-40 voorraadoplossingen bij min 80 graden Celsius.

Ontdooi de peptidevoorraadoplossing ongeveer vijf minuten voor het verzamelen van de gegevens. Meng in een centrifugebuis van 15 milliliter acht microliter van de peptideoplossing met 800 microliter gouden colloïdale deeltjes. Voeg 4,2 milliliter gedeïoniseerd gedestilleerd water toe en draai het monster vervolgens gedurende 10 seconden.

Stel de concentratie van A bèta 1-40 peptiden vast op 1,8 nanomolair en pas de verhouding van peptiden tot gouden colloïdale deeltjes binnen het specifieke bereik aan. Stel de oplossing met behulp van de temperatuurregeleenheid van de zichtbare UV-spectrofotometer in op kamertemperatuur, ongeveer 22 graden Celsius. Controleer de initiële pH van de monsteroplossing met behulp van een pH-meter en stel deze in op iets onder pH zeven.

Verzamel het absorptiespectrum binnen het bereik van 400 tot 800 nanometer. Pas vervolgens de pH van het monster aan tot ongeveer pH vier door stappen van 1.0 microliter zoutzuur van 1.0 molair toe te voegen. Verzamel het absorptiespectrum over hetzelfde bereik van 400 tot 800 nanometer.

Pas vervolgens de pH van het monster aan op ongeveer pH 10 door ongeveer 1.5 microliter 1.0 molaire natriumhydroxide toe te voegen. Verzamel het absorptiespectrum binnen hetzelfde golflengtebereik van 400 tot 800 nanometer. Verander daarna de pH tussen pH vier en pH 10 10 keer door zoutzuur of natriumhydroxide toe te voegen.

Verzamel continu het absorptiespectrum bij 25 graden Celsius. Verkrijg de ASCII-dataset van golflengten als functie van de absorptie. Gebruik het PeakFit-programma om de gemiddelde posities van de bandpieken te extraheren.

Gebruik de plotfunctie om de dataset te plotten om de optische dichtheid te visualiseren als functie van de golflengte. Identificeer en markeer de initiële piekgolflengten, lambda één en lambda twee, door hun geschatte posities in de geplotte gegevens te selecteren. Pas de gegevens aan met behulp van de peak fit-functie van het origin-programma.

Verkrijg de grafiek met de centrale piekposities voor elke lambda die is gelabeld als XCI, samen met de bijbehorende bandgebieden, aangeduid als AI. Exporteer de geëxtraheerde piekposities en bijbehorende gebieden naar een spreadsheetprogramma voor analyse. Bereken de wegingsfactor, AI, voor elk piekcentrum door de oppervlakte van de band te vergelijken met de totale oppervlakte van de hele banden met behulp van de weergegeven formule. Extraheer vervolgens de gemiddelde piekpositie met behulp van de vergelijking die op het scherm wordt weergegeven.

Om een omkeerbaarheidsgrafiek te genereren, maakt u een tabel van de gemiddelde piekposities als functie van het bewerkingsnummer N.Wijs het bewerkingsnummer N toe zoals vermeld op het scherm. Analyseer de piekpositie op N met behulp van de weergegeven formule. Breng de berekende dataset over naar de oorsprongssoftware en plot deze.

Selecteer de niet-lineaire curve-aanpassing van de analyse, voer de beginwaarden voor A, B, C, D en E in en klik op uitvoeren om het curve-aanpassingsproces te voltooien. Om Raman-beeldvorming uit te voeren, plaatst u voor elk monster met bewerkingsnummer N 100 microliter oplossing op een micaschijf met een diameter van één centimeter. Laat de monsters een nacht drogen voordat u ze gaat meten.

Verzamel vervolgens witlichtafbeeldingen voor elk bewerkingsnummer N. Bereid het afzonderlijke monster voor op een nieuwe micaschijf, aangezien de pH continu wordt gewijzigd tussen vier en 10. Verzamel het Raman-beeld voor elk bewerkingsnummer en gebruik de genoemde specificaties van een laser met een golflengte van 633 nanometer. Leg beelden vast in een raster van 100 bij 100 pixels met een specifieke integratietijd, gericht op het gewenste spectrale gebied.

Plot het representatieve spectrum voor elk operatienummer N uitgelijnd als een functie van N.Construeer een driedimensionale oppervlakte-verbeterde Raman-spectroscopie, of SERS-spectrum, als een functie van N voor A bèta 1-40-gecoat 20 nanometer goud. Gebruik het bovenaanzicht van het spectrum als een contourkaart om de specifieke modi te extraheren die verband houden met een bepaalde pH-conditie. Identificeer spectrale kenmerken die uitsluitend zijn verbeterd bij alleen even of oneven bewerkingsnummers.

De SPR-band van A beta 1-40-gecoate gouden nanodeeltjes verschoof van 530 nanometer naar ongeveer 650 nanometer toen de oplossing zuurder werd gemaakt. Dit kwam overeen met de vorming van goudcolloïde aggregaten met ongevouwen A bèta 1-40 monomeren zoals waargenomen door TEM. De pH-afhankelijke kleurverandering van A beta 1-40-gecoat goud was ook duidelijk.

De omkeerbare pH-afhankelijke verschuiving van de gemiddelde band piekte tussen een kortere en langere golflengte, en de alternatieve verspreide en geaggregeerde morfologie die in TEM werd waargenomen, bevestigde de quasi-omkeerbare aard van het proces. Beeldvorming met wit licht toonde een duidelijk, omkeerbaar aggregatiepatroon dat overeenkwam met de pH-verschuivingen, terwijl de SERS-spectra subtiele pH-afhankelijke veranderingen in het vingerafdrukgebied vertoonden.