Isolatie en identificatie van bacteriestammen uit de huid van terrestrische amfibieën

Dit onderzoek was gericht op het ontwikkelen van een efficiënt protocol voor het verzamelen van huidmicrobiota van wilde terrestrische amfibieën en het waarborgen van de microbiële integriteit tijdens opslag en behandeling.

Belangrijke uitdagingen zijn onder meer het voorkomen van monsterbesmetting, het behouden van de microbiële levensvatbaarheid tijdens opslag en het kweken van langzame groei om de diversiteit van de microbiota van de amfibieënhuid volledig te beoordelen.

Er werd vastgesteld dat met glycerol versterkte zoutoplossing de integriteit van de microbiota van de amfibieënhuid behoudt tijdens opslag en behandeling, consistente bacterieteelt en het verbeteren van microbiële conserveringsstrategieën voor ecologisch en biotechnologisch onderzoek.

Dit protocol pakt het gebrek aan gestandaardiseerde bemonsteringsmethoden aan, bewaart en behandelt kweekbare amfibieënhuidbacteriën en zorgt voor de integriteit van de gemeenschap.

[Verteller] Steriliseer om te beginnen het medium door te autoclaveren bij 121 tot 134 graden Celsius gedurende 15 tot 30 minuten. Laat het agarmedium na het autoclaveren afkoelen tot ongeveer 45 tot 50 graden Celsius. Giet het afgekoelde medium onder een eerder gesteriliseerde laminaire stromingskap in steriele petrischaaltjes. Zodra de agar is gestold, labelt u de petrischaaltjes met het gemiddelde type en de bereidingsdatum. Meng het uit het veld verkregen monster met de oplossing door het wattenstaafje tegen de wanden van de buis te duwen terwijl u in de buis knijpt en het wattenstaafje grondig draait, 10 keer met de klok mee en 10 keer tegen de klok in. Meng het microbiologische monster grondig voordat u het verwerkt. Bereid de seriële verdunning van het huidmonster voor met een zoutoplossing van 10 tot de macht -1 tot 10 tot de macht -6. Inoculeer 100 microliter van het onverdunde monster en seriële verdunning op de voorbereide agarplaten. Gebruik een steriele L-vormige lus om het monster over het oppervlak van het agarmedium te strijken, zodat het gelijkmatig wordt verdeeld zonder overmatige druk uit te oefenen. Keer de geënte platen om en plaats ze gedurende drie tot vijf dagen in een broedmachine die is ingesteld op 20 tot 25 graden Celsius om de groei van mesofiele en psychotrope bacteriën op de huid van amfibieën te ondersteunen. Selecteer na de incubatie bacteriekolonies met verschillende morfologieën voor verdere analyse. Zorg ervoor dat de kolonies goed geïsoleerd zijn en verschillende verschijningsvormen vertonen, zoals variaties in kleur, grootte, vorm, rand, oppervlak of textuur. Om de geselecteerde kolonies te subculturen, brengt u een goed geïsoleerde kolonie over van de originele agarplaat naar een verse agarplaat met behulp van een inoculatielus onder aseptische omstandigheden. Streak de kolonie uit om deze te isoleren. En broed het dan op de juiste manier uit. De gecoördineerde bemonsteringsprocedure van een speleomantes italicus individu met behulp van steriel gereedschap in een veldomgeving wordt hier getoond. De bemonstering werd uitgevoerd door twee operators met behulp van steriele handschoenen en wattenstaafjes om de belasting van de amfibie te minimaliseren en precisie tijdens het hanteren te garanderen. Het wattenstaafje werd onmiddellijk overgebracht in een zoutoplossing met 20% glycerol om de microbiële integriteit tijdens het transport naar het laboratorium te behouden. Een vergelijking van de dichtheid van de microbiële gemeenschap bewaard in een zoutoplossing met en zonder glyceroltoevoeging wordt hier getoond. De bacteriële belasting in de opslag van zoutoplossing zonder glycerol was significant lager dan de controle- en zoutoplossing met glycerol. De microbiële gemeenschap die in zoutoplossing met glycerol was bewaard, vertoonde een vergelijkbare bacteriële belasting als de controlegroep, wat wijst op het behoud van de microbiële integriteit. De beste conservering van de microbiële gemeenschap werd waargenomen in zoutoplossing met glycerol bewaard bij vier graden Celsius, met de meest stabiele bacteriële belasting in de loop van de tijd. Opslag in zoutoplossing alleen bij kamertemperatuur resulteerde in de hoogste bacteriegroei, wat wijst op microbiële besmetting of selectieve promotie van bepaalde bacteriegroepen. Bevriezing bij min 20 graden Celsius verminderde de bacteriële belasting, wat suggereert dat lage temperaturen een negatieve invloed hadden op de overleving van microben.