Driedimensionale beeldvorming van tumordragend weefsel met behulp van de iteratieve bleking breidt de multiplexiteitsbenadering uit

Dit onderzoek richt zich op het identificeren van doelwitten voor immunomodulerende geneesmiddelen en complexe solide gastro-intestinale tumoren. Het analyseren van het cellulaire landschap van de micro-omgeving van de tumor is absoluut cruciaal voor het begrijpen van de gevoeligheid voor behandelingen zoals immunotherapie. Single-cell sequencing en flowcytometrie helpen bij het karakteriseren van de micro-omgeving van de tumor, maar missen ruimtelijke context. Onlangs zijn er multiplexbeeldvormings- en transcriptomische platforms ontstaan om de micro-omgeving van de tumor in zijn in-vivo-context te bestuderen.

Beschikbare multiplextechnologieën voor het analyseren van de micro-omgeving van de tumor, iteratief of alles-in-één, zijn beperkt tot twee dimensies. Dit protocol breidt de karakterisering uit tot in de dieptedimensie en biedt inzichten die verder gaan dan enkele FFPE of bevroren secties.

[Verteller] Breng om te beginnen de tissuevellen over naar een monsterbeker met warm oogstmedium en plaats deze op een verwarmingsplaat op de voorbereidingstafel. Monteer het weefsel op platforms in een plaat van 15 centimeter met oogstmedium. Drapeer het tumordragende weefsel voorzichtig met de mesotheliale kant naar boven over de kleine openingszijde van het platform en zet het vast met een 2-0 zijden hechtdraad. Plaats het voorbereide weefselplatform omgekeerd volledig ondergedompeld in een plaat met 24 putjes met oogstmedium. Voeg voor fixatie 10 milliliter fixeermiddel toe aan een conische buis van 50 milliliter met 30 milliliter koude PBS om 40 milliliter fixatiebuffer voor te bereiden. Breng met een tang het op platforms gemonteerde weefsel over naar de fixatiebuffer. En broed 24 uur bij 4 graden Celsius. Decanteer het fixatief. Vervang het door 40 milliliter koude PBS. En broed gedurende 10 minuten bij 4 graden Celsius. Voeg voor het kleuren 1 milliliter blokkeerbuffer toe aan een putje en breng het weefselplatform in. Blokkeer minimaal twee uur bij kamertemperatuur op een tuimelschakelaar die is ingesteld op een laag toerental van 30 RPM. Bereid 0,8 milliliter antilichaamkleurstofoplossing in een microcentrifugebuisje en centrifugeer gedurende twee minuten bij kamertemperatuur op 10.000 g. Breng 0,75 milliliter van het bovenstaande over in een schoon putje van een incubatieplaat met 9 putjes. En plaats een gewassen platform. Wikkel het bord in aluminiumfolie. En incubeer minimaal twee uur bij kamertemperatuur op een tuimelschakelaar die is ingesteld op een lage snelheid van 30 RPM. Was het platform in een conische tube van 50 milliliter met 40 milliliter PBS gedurende 10 minuten op 4 graden Celsius. Voeg 0,1 milliliter PBS toe aan het midden van de glazen bodem van een beeldvormende schotel van 3,5 centimeter en zet deze opzij. Schroef de hoogteverstelring losjes met de klok mee in het buitendeksel. En monteer het platform in de binnenste plastic houder, zodat de inkepingsgroef uitlijnt. Zet het platform vast met de schuifregelaar. Plaats de gemonteerde beeldverwerkingsadapter op de glazen bodemschaal en laat de hoogteverstelring voorzichtig zakken totdat het weefsel de buffer raakt. Zodra de optimale afstand tot het glas is bereikt, voegt u 0,2 milliliter PBS toe aan het weefsel met de onderkant naar boven om uitdroging van het weefsel tijdens de beeldvorming te voorkomen. Start de software voor het verzamelen van afbeeldingen. Selecteer het juiste objectief, zoals 20X of 40X, en voeg het bijbehorende onderdompelingsmedium toe. Kies de parameters voor beeldacquisitie, zoals een scansnelheid van 600 hertz, een XY-resolutie van 1024 bij 1024 pixels, gemiddelden van drie lijnen en een bidirectionele scan. Selecteer de juiste laserlijnen of pas de witlichtlaser aan zodat deze overeenkomt met de excitatie- en emissiespectra van de fluoroforen die voor de kleuring worden gebruikt. Plaats de gemonteerde beeldverwerkingsschaal in de monsterhouder op de microscooptafel. Centreer het monster met behulp van de XY-bediening, breng het objectief naar het afdekglas en begin met het verkrijgen van afbeeldingen. Voer na elke beeldvormingsronde een bleekstap uit. Bereid 5 milliliter 1,5 milligram per milliliter lithium-borohydrideoplossing in gedestilleerd water en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Breng 1 milliliter van de lithiumboorhydrideoplossing over in een schoon putje van de incubatieplaat met 9 putjes en plaats het gewassen platform gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur. Was het platform kort in 20 milliliter PBS in een conische buis. Controleer op het resterende fluorescentiesignaal met behulp van de hoogste laserinstelling voor Z-compensatie. Een tumordragend peritoneaal monster gekleurd met de eerste ronde van iteratieve bleking breidt multiplexiteit uit, of IBEX 1, paneel voor visualisatie wordt hier getoond. Tumorlaesies werden geïdentificeerd als rozetachtige structuren die dubbel positief waren voor CD44 en podoplanine met nucleaire arrangementen die kenmerkend zijn voor papillair mesothelioom. Immunofluorescentiebeelden met hoge resolutie van geselecteerde regio's uit het tumordragende peritoneale monster worden hier getoond. Deze beelden onthullen tumorregio's en tumor tertiaire lymfoïde structuurinterfaces, waarbij consistente infiltratie van immuuncellen met een hoge dichtheid van CD45-positieve cellen wordt benadrukt. Deze figuur toont de iteratieve immunofluorescentiekleuring over IBEX-cycli één tot zes, en illustreert de ruimtelijke verdeling van immuun- en structurele markers binnen de interface van de tumorlaesie en de tertiaire lymfoïde structuur van de tumor. De maximale projecties van verschillende optische secties worden hier weergegeven. Deze 3D-beeldvorming bevestigde dat tumorlaesies en tertiaire lymfoïde structuren zich op verschillende Z-diepten bevinden, wat de beperkingen van 2D-beeldvorming aantoont bij het vastleggen van complexe weefselarchitectuur.