Isolatie en analyse van aortaboog- en wortellaesies in een atherosclerotisch muismodel

Studie onderzoekt de ontwikkeling van atherosclerotische laesies in de aortaboog en wortel van LDLR-knockoutmuizen en biedt een protocol voor isolatie, kleuring en analyse om de ernst van de plaquesamenstelling van atherosclerose te beoordelen. Naast histologisch onderzoek dat in deze studie is gebruikt, omvatten praktische technieken voor het beoordelen van atherosclerose ook biochemische markers, moleculair-biologische tests en vasculaire echografie. De precisie van de dissectieprocedure vormt de grootste technische hindernis bij het uitvoeren van in vivo aortastripping binnen het muismodel van atherosclerose.

Plaats om te beginnen de geëuthanaseerde muizen in rugligging op een schuimplaat bedekt met een tot twee lagen absorberend papier. Bevestig de ledematen met pinnen om het lichaam te stabiliseren. Spuit 75%ethanol over de buik van de muizen om de vacht schoon te maken en te bevochtigen.

Gebruik een tang om de buikhuid van de muis vast te pakken. Knip vervolgens met een fijne schaar de huid van de basis van de buik tot de bovenkant van de nek. Open de buikwand en gebruik een tang om het borstbeen op te tillen.

Snijd zowel het middenrif als de ribben door om de borstholte bloot te leggen. Verwijder de slokdarm en luchtpijp om het reinigen van de halsslagaders te vergemakkelijken. Verwijder voorzichtig organen, waaronder de lever, longen, milt, maagdarmkanaal en alvleesklier, terwijl de nieren en de abdominale aorta behouden blijven.

Bij het ontleden van de mesenteriale slagaders, til de darmen op en maak incisies weg van de aorta om schade te voorkomen. Plaats nu de muis onder een stereomicroscoop om een duidelijk waarnemingsveld te bieden en lijn een koude lichtbron uit met het dissectiegebied. Gebruik een spuit van 10 milliliter gevuld met PBS om langzaam met een naald in de linkerventrikeltop te injecteren en observeer de verwijding van de aorta.

Veeg bloed en vloeistof in het dissectiegebied voorzichtig weg met tissuepapier om het gezichtsveld volledig bloot te leggen. Pak vervolgens het middenrifsegment van de thoracale aorta vast met een tang en gebruik een veerschaar om het bindweefsel tussen de aorta en de thoracale spierwand door te knippen. Trek voorzichtig met een tang aan het hart en til de thoracale aorta op.

Observeer de takken van de aortaboog en ontleed het adventitiële vet en bindweefsel rond de aortaboog en de takken naar boven langs de thoracale aorta. Ontleed de abdominale aorta en de gemeenschappelijke darmbeenderen naar beneden langs de thoracale aorta. Snijd het hartweefsel af en snijd de onderste helft van het hart langs een vlak evenwijdig aan de boezems en plaats het bijgesneden hart op een geschikt opslagmedium.

Voordat u de aortaboog ontleedt, plaatst u er een kleine donkergekleurde pakking onder om contrast te creëren. Maak een foto van het gebied van de aortaboog. Snijd de gemeenschappelijke darmbeenderen één tot twee millimeter onder hun vertakking af en knip de kleine takken van de aorta langs de wervelkolom af om deze vrij te maken.

Nadat u de nierslagaders bij de nieren hebt losgemaakt, snijdt u de drie vertakkingen in de nek af van hun distale uiteinden. Snijd ten slotte de aorta ascendens bij het hart door. Bereid van tevoren een milliliter 4% paraformaldehyde-oplossing in een centrifugebuis van 1,5 milliliter.

Plaats de aorta in de voorbereide buis en fixeer deze minimaal 24 uur op kamertemperatuur. Breng vervolgens de aorta over naar een petrischaaltje met PBS om te voorkomen dat deze uitdroogt. Verwijder onder een stereomicroscoop voorzichtig al het resterende adventitieve vet met behulp van een tang en een veerschaar om interferentie bij het kwantificeren van tandplak te verminderen.

Knip met een veerschaar de aorta voorzichtig open langs de binnenste lengteas. Snijd achtereenvolgens de drie takken van de aortaboog langs de zijkant open tot het niveau van de kromming van de aortabogen, zodat deze zich volledig kan uitspreiden. Ga in dit stadium verder met olierood O-kleuring of bewaar de aorta in 4% paraformaldehyde voor toekomstige analyse.

Plaats de opengesneden aorta in een bord met zes putjes. Voeg een milliliter steriel dubbel gedestilleerd water toe aan elk putje en was gedurende vijf minuten op een shaker. Plaats de plaat met zes putjes in een zuurkast en laat 20 minuten aan de lucht drogen totdat er geen zichtbare watermerken meer zijn.

Voeg een milliliter vers bereide Oil Red O-werkoplossing toe aan elk putje. Nadat u de plaat 20 minuten hebt geschud, verwijdert u de Oil Red O-oplossing uit de putjes. Voeg twee milliliter steriel dubbel gedestilleerd water toe aan elk putje en was gedurende vijf minuten.

Bewaar de aorta na drie wasbeurten in dubbel gedestilleerd water. Breng de aorta over op een dia en plaats een zwart rubberen kussen onder de dia om het contrast te vergroten. Spreid de aorta uit terwijl u onder de stereomicroscoop kijkt.

Plaats nu de dia op een wit papier om het contrast verder te verbeteren. Plaats een liniaal naast de dia en maak een foto met een camera. Bewaar de behandelde aorta in een centrifugebuis van 1,5 milliliter met daarin één milliliter PBS om deze vochtig te houden.

Het lichaamsgewicht van LDLR-knock-outmuizen die werden gevoed met een westers dieet nam aanzienlijk toe in vergelijking met muizen die werden gevoed met het chow-dieet. Plasmatriglyceriden en totaal cholesterolgehalte waren significant hoger in de westerse dieetgroep dan in de controlegroep. Aortic Oil Red O-kleuring vertoonde ernstige lipidenaccumulatie in de slagaders van LDLR-knock-outmuizen die werden gevoed met het westerse dieet in vergelijking met degenen die een chow-dieet volgden.

Verhoogde lipideafzettingen correleerden met ernstigere atherosclerotische laesies. Het laesiegebied van de aortawortel en de necrotische kern waren significant groter bij muizen die met het westerse dieet werden gevoed in vergelijking met muizen die met het dieet werden gevoed. Kwantificering van het laesie van de aortawortel en het necrotische gebied bevestigde dat het westerse dieet de vorming van atherosclerotische plaques bij LDLR-knock-outmuizen verergerde.