Analyse van subpopulaties van bloedplaatjes door middel van meerkleurige flowcytometrie

Ons onderzoek maakt gebruik van meerkleurige flowcytometrie om subpopulaties van bloedplaatjes te identificeren en te karakteriseren, met als doel de rollen, activeringspatronen en klinische relevantie in trombose, ontsteking en ziektespecifieke context te begrijpen. De gevestigde multicolor flow cytometrische test maakt het mogelijk om de , een bloedplaatjestagonist induceert een duidelijk activeringspatroon en genereert in vergelijking met collageengerelateerd peptide een procoagulans en van subpopulatie. De meerkleurentest maakt de gelijktijdige meting mogelijk van de activering, adhesie, aggregatie en apoptotisch potentieel van een enkele bloedplaatje binnen een populatie van geïsoleerde menselijke bloedplaatjes in een enkele buis.

[Docent] Bereid om te beginnen alle reagentia voor die nodig zijn voor de procedure. Meng nu 10 milliliter 10x Tyrode's buffer met 90 milliliter gedestilleerd water. Voeg 0,1 gram glucose toe en pas de pH van het volledige volume aan met hepes tot 7,4. Stel eerst de pH van 10 milliliter van de buffer in op 7,4 en pas vervolgens de pH van de resterende 90 milliliter met één normaal zoutzuur aan op 6,5. Maak voor het afnemen van bloedmonsters voor elke donor een spuit van 10 milliliter klaar met twee milliliter ACD-antistollingsmiddel. Laat de spuit bij kamertemperatuur in evenwicht komen. Nadat u donorbloed hebt verzameld in een voorverwarmde ACD-spuit, brengt u het met ACD behandelde bloed langzaam over in een reactiebuis van 15 milliliter. Centrifugeer het met ACD behandelde bloed op 209 G gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur zonder de pauze te gebruiken. Bereid ondertussen 25 milliliter Tyrode's Hepes-buffer, pH 6,5 in een reactiebuis van 50 milliliter. Breng na het centrifugeren de bovenste bloedplaatjesrijke plasmalaag voorzichtig over in de buis met de Hepes-buffer van Tyrode. Om besmetting te voorkomen, laat u ongeveer een milliliter bloedplaatjesrijk plasma boven de buffy-laag en de erytrocytenlaag over. Centrifugeer vervolgens de suspensie bij 430 G gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur om de bloedplaatjes te pelleteren. Gooi het bovenstaande weg en suspendeer de bloedplaatjeskorrel voorzichtig opnieuw in 200 tot 300 microliter van de buffer van Tyrode, aangepast aan pH 7,4. Meet het aantal bloedplaatjes met behulp van een cellenteller voordat u het instelt op 200.000 bloedplaatjes per microliter met Tyrode's Hepes-buffer bij pH 7,4. Voor receptoren die niet hoeven te worden geactiveerd voorafgaand aan kleuring, waaronder CD61, CD42B, CD41, CXCR7 en CXCR4, bereidt u één ongekleurd en één gekleurd monster per antilichaam voor. Voor receptoren of markers die activering vereisen, zoals PAC-1, CD63, CD62P, NXN5 en zombie NIR. Activeer het monster met 10 microgram per milliliter CRPXL en bereid zowel geactiveerde als niet-geactiveerde monsters voor. Om de bloedplaatjes te activeren, incubeer je ze met 10 microgram per milliliter CRPXL gedurende 30 minuten. Incubeer vervolgens de geïsoleerde bloedplaatjes met variërende concentraties van het fluorgeconjugeerde antilichaam of sterf gedurende 30 minuten. Voeg vervolgens 300 microliter anexinebindingsbuffer toe aan elk monster om het te verdunnen. Meet 10.000 gebeurtenissen voor elk monster met behulp van een flowcytometer. Bereken de kleuringsindex voor elk antilichaam om de optimale scheiding tussen positieve en negatieve populaties te bepalen. Zet de kleuringsindex af tegen antilichaamconcentraties om de optimale concentratie voor elk antilichaam te bepalen Los voor het kleuren heempoeder op in 1,4 M natriumhydroxide om een 3M-oplossing te maken. Verwarm de oplossing gedurende vijf minuten tot 96 graden Celsius met 450 omwentelingen per minuut. Verdun het met gedestilleerd water om een steeloplossing van drie millimolair te verkrijgen. Nadat u het aantal bloedplaatjes hebt aangepast naar 1 miljoen bloedplaatjes per monster, activeert u de bloedplaatjes zoals eerder gedemonstreerd. Voeg 43,3 microliter antilichaamcocktail toe aan elk monster en incubeer ze 30 minuten bij kamertemperatuur in het donker. Verdun na incubatie elk monster met 300 microliter van één X en X in een bindingsbuffer bestaande uit 10 millimolair Hepes-natriumhydroxide bij pH 7,4. Meet elk gekleurd monster onmiddellijk met behulp van de flowcytometer. Voor compensatie met kralen bereidt u 150 microliter PBS voor elke fluorofoor en voegt u een druppel kralen en een microliter van het fluorescentiegeconjugeerde antilichaam toe. Om annexine V te compenseren, gebruikt u PECY7B zeven kralen gelabeld met anti-humaan CD 62L geconjugeerd aan dezelfde fluorofoor als annexine V. Gebruik amine reactieve compensatiekorrels voor de amine reactieve kleurstof door twee druppels positieve kralen en één druppel negatieve korrels te mengen in 150 microliter PBS met één microliter matrijs. Controleer of de positieve kralen reageren en een signaal weergeven en de negatieve kralen niet. Bereid een fluorescentie min één regelaar voor elke marker voor. De spreidingsdiagrammen toonden een duidelijke verschuiving in de bloedplaatjespopulatie. Met hemin die meer bloedplaatjes vormt met een lage voorwaartse verstrooiing dan andere agonisten. Behandeling met ADP-trombine en CRPXL resulteerde in 40 tot 60% bloedplaatjes die CD42-positief waren, terwijl hemine deze populatie aanzienlijk verminderde. Alle bloedplaatjesagonisten hadden geen effect op de oppervlakte-expressie van CD41 en CD61. Alleen hemen verhoogde de oppervlakte-expressie van CXCR4 en CXCR7 aanzienlijk. Bovendien werd de blootstelling aan fosfatidylserine ook verhoogd onder behandeling met hemin, wat resulteerde in een versterking van annexine V-positieve cellen. UMAP- en fenolgrafiekanalyses definieerden 27 verschillende bloedplaatjesclusters, die varieerden per type agonist. Hemin veroorzaakte de meest dramatische verschuiving in clusterpatronen. Subpopulaties van rustende bloedplaatjes werden het meest bewaard met ADP en geleased met hemine.