Prion Veiligheid Laboratorium Swipe-test

Onze multidisciplinaire groep probeert te begrijpen hoe een infectieus eiwit, een prion, complexe biologische taken kan uitvoeren. We zijn ook geïnteresseerd in hoe prionen jaren tot decennia in het milieu kunnen blijven bestaan. Na prionontsmettingsprocedures was er geen robuuste methode beschikbaar om de werkzaamheid van prioninactivatie te bepalen.

Met ons onderzoek proberen we dit probleem aan te pakken. De zwabbermethode, in combinatie met RT-QuIC, maakt het mogelijk om een breed scala aan oppervlakken te bemonsteren om prionzaaiactiviteiten te detecteren. Dit kan worden gebruikt voor het detecteren van oppervlakte-geassocieerde prionen in laboratorium-, klinische of omgevingsomgevingen.

Ik ben geïnteresseerd in het begrijpen van hoe prionen interageren met oppervlakken en de vereisten van oppervlaktegebonden prionen om infectie vast te stellen. Identificeer en label om te beginnen de juiste bewakingsgebieden voor uitstrijkjes. Bereid twee microcentrifugebuisjes van 1,5 milliliter voor elk geïdentificeerd gebied voor en voeg 250 microliter DPBS toe aan de eerste buis, zodat de tweede leeg blijft.

Haal wattenstaafjes met schuimpunt uit de opslag in een ruimte die vrij is van prionbesmetting. Bereid de positieve en negatieve controles voor met behulp van geschikte hersenhomogenaten of BH in DPBS. Haal met schone handschoenen het vereiste aantal schuimwattenstaafjes uit de verpakking en plaats ze met het handvat naar beneden in een buizenrek.

Zorg ervoor dat de uiteinden niet in contact komen met andere oppervlakken. Houd een schoon schuimstaafje bij het handvat en breng 50 microliter van de respectievelijke positieve en negatieve controlemonsters aan op de tips van het wattenstaafje. Knip met een schaar het overtollige handvat van het wattenstaafje af tot ongeveer de helft van de lengte en plaats het wattenstaafje in de voorgeladen microcentrifugebuis om de schuimtip onder te dompelen in DPBS.

Houd een schoon wattenstaafje aan het handvat vast, maak de schuimtip nat met water van moleculaire kwaliteit en schud het overtollige water eraf. Plaats de bevochtigde schuimtip op het gebied dat is gekozen voor bewaking en veeg het gebied ongeveer 10 keer heen en weer terwijl u tegelijkertijd de wattenstaafje op het oppervlak draait. Knip met een schaar het overtollige handvat van het wattenstaafje af tot ongeveer de helft van de lengte en plaats het wattenstaafje in de voorgeladen microcentrifugebuis om de schuimtip onder te dompelen in DPBS, zodat het deksel volledig kan sluiten.

Gooi handschoenen weg en vervang ze door nieuwe voordat u naar de volgende uitstrijkplaats gaat om kruisbesmetting tot een minimum te beperken. Plaats voor het extraheren van het wattenstaafje de microcentrifugebuis in een rond buisrek en dompel het rek onder in het waterbad van de bekerhoornsonicater. Zorg ervoor dat het schuimwattenstaafje in DPBS in de buis zich onder het wateroppervlak bevindt en laat de handgreepgedeelten niet ondergedompeld.

Sonificeer het monster in totaal 15 seconden met vijf seconden aan en vijf seconden uit. Na sonicatie centrifugeert u de buis gedurende ongeveer 15 seconden om de DPBS op de bodem van de buis te verzamelen voordat deze wordt overgebracht. Gebruik een P 1000-pipet die is ingesteld op 250 microliter en verzamel voorzichtig al het vloeibare wattenstaafje van de bodem in de bijbehorende voorgeëtiketteerde lege buis.

Gooi het gebruikte buisje met het wattenstaafje weg. Concentreer het monster in een vacuümconcentrator en zorg ervoor dat de dop van de buis open is, zorg er na voltooiing van de cyclus voor dat het monster volledig is geconcentreerd en er nog maar een pellet over is. Bewaar de pellet bij min 80 graden Celsius tot verder gebruik.

Bereid voor RT-QuIC-analyse een negatieve en positieve plaatcontrole voor met overeenkomstige hersenhomogenaten verdund in weefselverdunningsoplossing. Ontdooi nu de opgeslagen wattenstaafjesextractpellet uit de vriezer van min 80 graden Celsius en suspendeer het gedroogde wattenstaafjesextract opnieuw met 50 microliter water van moleculaire kwaliteit door te pipetteren. Draai kort en laat het monster op kamertemperatuur staan.

Laad twee microliter negatieve en positieve plaatregelaars, gevolgd door uitstrijkjes, in de respectievelijke RT-QuIC-plaatputjes. Negatieve controlestaafjes overschreden de positieve fluorescentiedrempel niet, wat bevestigt dat er geen besmetting is tijdens de procedures. Extracten van positieve controlewattenstaafjes vertoonden een consistente zaaiing in alle gerepliceerde putjes, wat de juiste detectiegevoeligheid aantoont.

Monsters van oppervlakteuitstrijkjes uit niet-besmette gebieden vertoonden geen zaaien boven de drempelwaarde, wat de prionnegativiteit bevestigt. Met prionen verontreinigde oppervlakken, vertoonden zaaiing boven de drempel met gevarieerde maximale puntverhoudingen en fluorescentietijden in vergelijking met controles. Met bleekmiddel behandelde prion-besmette oppervlakken slaagden er niet in om RT-QuIC te zaaien, wat een effectieve desinfectie aantoont.

Sommige oppervlakteartefacten vertoonden veranderde kinetische curven en langere fluorescentietijden, wat wijst op mogelijke valse positieven, waarschijnlijk als gevolg van de aanwezigheid van stof of resterende chemicaliën op een oppervlak.