Toediening van vluchtige anesthetica aan zebravislarven voor gedragsobservatie

Ons onderzoek richt zich op anesthesiefarmacologie, waaronder een interesse in anesthesiemechanismen en de mechanismen van anesthesiebijwerkingen. Het gebruik van larvale zebravissen als gedragsmodel om anesthesiefarmacologie te bestuderen breidt zich snel uit en heeft veel voordelen, waaronder hun geschiktheid voor gebruik in grootschalige screeningsexperimenten. Vergelijking van vluchtige en intraveneuze anesthetica blijft een uitdaging omdat het toedienen van vluchtige anesthetica aan niet-waterdieren veel gemakkelijker is dan intraveneuze anesthetica.

Daarentegen worden intraveneuze anesthetica gemakkelijker toegediend aan waterdieren dan vluchtige anesthetica. Dit protocol biedt een relatief goedkope en toegankelijke manier om vluchtige anesthetica in een gesloten kamer toe te dienen om gedragsexperimenten uit te voeren bij larvale zebravissen. Andere protocollen van deze aard vereisen vaak een vorm van op maat gemaakte apparatuur die kostbaar of niet gemakkelijk toegankelijk kan zijn voor mensen die niet over de middelen beschikken om dit soort apparatuur te maken of aan te schaffen.

Leg om te beginnen een siliconenvel van 0,5 millimeter op een schoon, plat oppervlak. Inspecteer de vellen op eventuele kreukels en vermijd deze indien mogelijk. Reinig de vellen met 70% alcohol om olie of vuil te verwijderen.

Als het vel helemaal droog is, gebruik dan een applicator zoals een penseel om een dunne, gelijkmatige laag zelfklevende primer op het siliconenvel aan te brengen. Zodra de hechtprimer is aangebracht, lijnt u de dubbel gecoate tape uit met de siliconenplaat met de papieren achterkant naar boven. Breng de tape geleidelijk aan op de siliconen met behulp van een roller om het oppervlak glad te strijken en luchtbellen te verwijderen.

Breng de primer indien nodig opnieuw aan in kleine secties en ga door met het aanbrengen van tape terwijl de primer in één tot vijf seconden droogt. Draai het siliconenvel om om met de siliconenkant naar boven te werken om te helpen bij het visualiseren en verwijderen van luchtbellen. Snijd vervolgens de zelfklevende siliconen in stroken van minimaal 10 millimeter breed.

Zorg ervoor dat de stroken lang genoeg zijn om ten minste de breedte van een rij van de putplaat te bedekken. Om de vluchtige anesthetica te bereiden, voegt u een volume van het niet-vluchtige oplosmiddel toe aan een HPLC- of scintillatieflesje, waarbij u zorgt voor een minimale vrije ruimte zodra de laatste verdunning van het vluchtige anestheticum is toegevoegd. Gebruik een Hamilton-gasdichte spuit om het vluchtige verdovingsmiddel toe te voegen en sluit de injectieflacon snel af.

Meng de injectieflacons indien nodig door vortex of sonicatie. Bewaar ze tijdelijk tijdens het klaarmaken van zebravisborden. Om het gedragsexperiment op te zetten, brengt u vijf dagen na de bevruchting een larvale zebravis over naar elke andere rij van een glazen plaat met 96 putjes.

Verwijder voorzichtig de E-drie oplossing uit elk putje. Gebruik een transferpipet om elk putje in de rij te vullen met de experimentele oplossing. Druk de strip met behulp van de zelfklevende siliconenstrips snel naar beneden om te voorkomen dat er luchtbellen ontstaan en vissen in aangrenzende putten terechtkomen.

Druk vervolgens stevig op de bovenkant van de plaat om ervoor te zorgen dat elk putje is afgesloten. Herhaal het afdichtingsproces totdat de oplossing is verwisseld en alle putjes in elke andere rij van de plaat zijn afgedicht. Draai de plaat voorzichtig om en inspecteer op luchtbellen.

Plaats de plaat in de gedragsobservatie-eenheid met de siliconenkant naar beneden en voer het gedragsexperiment uit. In de afgesloten putjes vertoonde de concentratie sevofluraan een minimaal verlies gedurende drie uur, en isofluraan vertoonde een afname van 4% in concentratie. Geen van beide anesthetica vertoonde significant verlies tijdens de eerste 30 tot 60 minuten.

De mediane effectieve concentratie voor sevofluraan was 62 micromolair voor spontane beweging en 126 micromolair voor uitgelokte beweging, waarbij de ladder aanzienlijk lager was dan de eerder gerapporteerde 240 micromolair, wat te wijten kan zijn aan verbetering in het creëren van gasdichte afdichting met deze methode. Een significant verschil in spontane beweging werd waargenomen tussen open en afgesloten putten, ontstond na twee uur, waarschijnlijk als gevolg van de uitputting van zuurstof in de put, en is een belangrijke beperking van deze techniek.