Studie van door kopernanodeeltjes geïnduceerde geprogrammeerde celdood in bacteriën

Dit onderzoek onderzoekt de nanopartiële bacteriedodende werkzaamheid van koper tegen drie veel voorkomende klinisch significante bacteriën. Het onderzoekt casussen, waaronder ROS-generatie en mogelijke betrokkenheid van geprogrammeerde celdood.

Een van de huidige uitdagingen is het bereiken van consistente kolonietellingen. Ik geloof dat dit voortkomt uit interventie. Celmodernisering tijdens verdunning leidt tot neptelling met locatie in vergelijking met meer ervaren tellen.

Onze groep was de eerste die een celmodulator gebruikte om bacteriedodende mechanismen van kopernanodeeltjes te bestuderen, waaruit bleek dat bacteriële dood cellulaire processen zoals ROS-generatie en autofagie met zich meebrengt.

Het protocol komt tegemoet aan de behoefte aan een beter begrip van het mechanisme waarmee kopernanodeeltjes bacteriën doden, met name gericht op het onderbelichte gebied van bacterieel geprogrammeerde celdoodroutes.

Met behulp van verschillende celmodulatoren hebben we bevestigd dat door kopernanodeeltjes geïnduceerde bacteriële dood autofagie en ROS-overbelasting met zich meebrengt en hebben we belangrijke routes geïdentificeerd die worden ondersteund door betrouwbare experimenten op basis van drievoud met een eenvoudig ontwerp

[Verteller] Om te beginnen verkrijg je commerciële kopernanopoeders met een diameter van 25 nanometer en 60 tot 80 nanometer van een commerciële leverancier. Gebruik één milliliter van één millimolair SDS als dispergeermiddel voor elke nanodeeltjesgrootte. Dispergeer de nanodeeltjes vervolgens met behulp van een ultrasoonbad gedurende ten minste 30 minuten bij kamertemperatuur. Verkrijg vervolgens de stammen Escherichia coli, Acinetobacter baumannii en Staphylococcus aureus bij de respectievelijke biologische hulpbronnencentra. Kweek elke bacterie in 10 milliliter LB-bouillon onder aërobe omstandigheden bij 37 graden Celsius. Verdun bacterieculturen in LB-medium om een optische dichtheid van ongeveer 0,5 bij 600 nanometer te bereiken. Gebruik nu standaard koperen nanodeeltjesoplossingen om een reeks concentraties te bereiden tussen nul en 100 microgram per milliliter van beide maten. Pipetteer 500 microliter van de bacterieculturen in microcentrifugebuisjes en centrifugeer bij 3.300 G gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Nadat u het supernatant hebt uitgepipetterd, voegt u verschillende concentraties van beide groottes van de nanodeeltjes toe aan elke buis. Behandel controlegroepen met 500 microliter PBS als negatieve controle en 500 microliter 70% alcohol als positieve controle. Incubeer vervolgens alle monsters door gedurende 24 uur te schudden met 200 omwentelingen per minuut bij 37 graden Celsius. Was de bacteriën na incubatie met PBS en verspreid ze over LB-agarplaten. Incubeer de platen 24 uur bij 37 graden Celsius. Tel de volgende dag kolonies op elke plaat voor alle behandelingsgroepen. Behandel bacteriën met vijf micromolaire SBI gedurende twee uur, 0,5 micromolaire necrosulfonamide gedurende één uur, 100 nanomolaire wortmannine gedurende 30 minuten of 100 nanomolaire Z-VAD gedurende 30 minuten. Nadat alle voorbehandeling is voltooid, centrifugeert u alle buisjes gedurende 10 minuten bij 3.300 G. Resuspendeer vervolgens de pellet in 800 microliter PBS om de voorbehandelingsmodulator te wassen. Verdeel de geresuspendeerde pellets. Centrifugeer elke buis en gooi vervolgens de supernatant weg. Resuspendeer de pellets in mengsels van nanodeeltjesmodulatoren voordat ze worden geïncubeerd met agitatie. Voeg nu 70% ethanol en PBS toe als positieve en negatieve controles. Inclusief blanco controlegroepen die zijn behandeld met remmers, maar geen nanodeeltjes. Na incubatie wordt het reagens voor de levensvatbaarheid van de cellen in een volumeverhouding van één tot tien pipetter en geïncubeerd. Nadat de culturen opnieuw zijn gecentrifugeerd, brengt u de bovenstaande middelen over naar platen met 96 putjes. Meet fluorescentie bij 560 nanometer excitatie en 590 nanometer emissie met behulp van een microplaatlezer. Verdun de resterende supernatanten tot 10 tot de macht min vijf en 10 tot de macht min vier en verdeel over LB-agarplaten tot kweek. Tel de afzonderlijke volken de volgende dag. Pipetteer bacterieculturen in microcentrifugebuisjes. Stel de culturen vervolgens drie uur lang bloot aan ultraviolet licht van 405 nanometer. Incubeer de culturen vervolgens twee uur lang bij 45 graden Celsius. Incubeer de bacteriën vervolgens twee uur lang bij vier graden Celsius. Incubeer de bacteriën na de koudebehandeling gedurende 30 minuten in 3% waterstofperoxide. Houd een controlegroep op 37 graden Celsius in LB-bouillon. Behandel nu bacteriën met deeltjes van 20 of 60 nanometer in concentraties tussen één en 100 microgram per milliliter gedurende 24 uur. Was de behandelde bacteriën vervolgens twee keer met PBS. Resuspendeer de bacteriële pellets na het centrifugeren in een oplossing van vijf micromolaire stoffen van 2',7' dichloordihydrofluoresceïnediacetaatkleurstof. Analyseer de fluorescentie-intensiteit bij een emissie van 520 of 530 nanometer. Het aantal kolonies van Escherichia coli werd significant verminderd met 20 nanometer kopernanodeeltjes met één microgram per milliliter en met 60 nanometer kopernanodeeltjes met vijf microgram per milliliter. Staphylococcus aureus vertoonde significante verminderingen van het aantal kolonies bij alle concentraties van beide nanodeeltjesgroottes. In Acinetobacter baumannii vereiste een vermindering van het aantal kolonies vijf microgram per milliliter koperen nanodeeltjes van 20 nanometer en 10 microgram per milliliter koperen nanodeeltjes van 60 nanometer. Behandelingen met kopernanodeeltjes induceerden de productie van reactieve zuurstofsoorten in alle bacteriën, waarbij deeltjes van 20 nanometer de hoogste fracties van positieve cellen vertoonden bij lagere concentraties. Daarentegen leidden behandelingen met kopernanodeeltjes van 60 nanometer tot een consistente generatie van reactieve zuurstofsoorten in alle concentraties. Geprogrammeerde celdoodmodulator Z-VAD verhoogde de overleving van Escherichia coli behandeld met beide nanodeeltjesgroottes in lage tot matige concentraties. NSA-behandeling verbeterde de overleving van Staphylococcus aureus in alle concentraties van 20 nanometer kopernanodeeltjes. Acinetobacter baumannii vertoonde een verbeterde levensvatbaarheid met Z-VAD onder één, vijf en 10 microgram per milliliter van zowel 20 als 60 nanometer blootstelling aan koperdeeltjes, terwijl NSA de levensvatbaarheid verhoogde met slechts 10 microgram per milliliter van 20 nanometer blootstelling aan kopernanodeeltjes.