Snelle uitputting van niermacrofagen met behulp van menselijke CD59/Intermedilysin Cell Ablation Tool

We gebruiken intermedilysine-gemedieerde oblatie van de menselijke CD59-expressiecel bij muizen om de regeneratie van niermicrofagen te bestuderen, met de nadruk op chemokine-gedreven monocytenherstel en niche-instelling van immuunsurveillance na verwonding. Recente ontwikkelingen in ons vakgebied onthullen het mechanisme van de regeneratie van renale macrofagen, waarbij de nadruk wordt gelegd op een specifieke chemokine die macrofagen rekruteert en hoe immuunbewaking wordt hersteld na acuut nierletsel. We combineren tamoxifen-induceerbare cryogenetica, intermedialysine-ablatie, multi-parameter flowcytometrie en intravitale microscopie om niermacrofagen in realtime te ableren, te volgen en te visualiseren.

De belangrijkste uitdagingen zijn het vermijden van systemische ontstekingen, het richten op alleen residente macrofagen en het meten van snelle regeneratie zonder de delicate renale mIcro-omgeving te verstoren. We toonden aan dat monocyten 88% van de niermacrofagen herstellen binnen zeven dagen na ablatie, een proces dat kritisch afhankelijk is van de CX3 CR1, CX3 CL1-signaleringsas. Verwarm om te beginnen maïsolie voor op 42 graden Celsius.

Los 100 milligram tamoxifen op in vijf milliliter voorverwarmde maïsolie om een voorraadoplossing te bereiden met een concentratie van 20 milligram per milliliter. Dien tamoxifen intraperitoneaal toe aan mannelijke muizen van 10 tot 12 weken oud in een dosis van 100 microgram per gram lichaamsgewicht. Injecteer na 15 dagen een enkele intraveneuze dosis intermedilysine in de muizen in een dosis van 120 nanogram per gram lichaamsgewicht.

Bewaak en bevestig de ablatie van residente macrofagen en daaropvolgende regeneratie door flowcytometrie uit te voeren één, drie en zeven dagen na toediening van intermedialysine. Gebruik voor het verzamelen van de nieren een fijne tang en een schaar om een horizontale incisie te maken in de onderbuik van een geëuthanaseerde muis. Verleng de incisie verticaal langs de middellijn tot net onder de ribbenkast of het borstbeen.

Trek de huid en spier voorzichtig terug om de borstholte bloot te leggen. Snijd het rechter atrium open om het bloed uit de bloedsomloop te laten weglopen. Steek een naald van 21 tot 23 gauge in de linker hartkamer.

Begin met perfusie met 10 tot 20 milliliter koude PBS om bloed weg te spoelen. Ga door met perfusie totdat de nieren bleek lijken, wat wijst op een effectieve bloedklaring. Plaats de nieren tegen de dorsale lichaamswand en scheid ze voorzichtig van de omliggende weefsels met behulp van een tang en een schaar.

Snijd de niercapsules weg en plaats de nieren onmiddellijk in koude PBS om afbraak te voorkomen. Bereid 100 milliliter spijsverteringsenzymcocktail voor door calcium- en magnesiumvrije HBSS, collagenase IV en DNase I te mengen. Bereid de enzymoplossing vers en bewaar deze op ijs tot gebruik. Hak met een steriele schaar de nieren in kleine stukjes in een petrischaaltje met vijf milliliter HBSS.

Breng het gehakte nierweefsel over in buisjes van 15 milliliter met 10 ml van de bereide enzymoplossing. Incubeer de buisjes nu 30 minuten bij 37 graden Celsius met zacht roeren om het weefsel te dissociëren. Tritriureer het weefsel voorzichtig met behulp van een pipet of spuitzuiger om celklonters verder te breken.

Verwijder vuil door de celsuspensie door een celzeef van 40 micrometer te leiden. Centrifugeer de celsuspensie bij 700 G gedurende 10 minuten bij 18 graden Celsius. Decanteer vervolgens voorzichtig de buffer.

Resuspendeer de pellet in vijf milliliter lysisbuffer voordat u deze vijf minuten bij kamertemperatuur incubeert om rode bloedcellen te lyseren. Voeg PBS toe om de cellen te wassen en verwijder de lysisbuffer. Houd de resulterende eencellige suspensie op ijs tot verder gebruik.

Voor centrifugatie van de dichtheidsgradiënt resuspendeert u de celpellet eerst in 10 milliliter oplossing met een dichtheidsgradiënt van 30%. Breng dit voorzichtig aan over drie milliliter 70%density gradiëntoplossing in een centrifugebuis. Centrifugeer de gradiënt op 500 G gedurende 30 minuten zonder een pauze in te lassen.

Verzamel na het centrifugeren voorzichtig de interfacelaag tussen de 30%- 70%-oplossingen. Was de verzamelde cellen twee keer met 10 milliliter PBS en centrifugeer elke wasbeurt op 500 G gedurende 10 minuten. Resuspendeer de uiteindelijke celpellet in één milliliter FACS-buffer in een buis van 1,5 milliliter.

Tel de cellen met behulp van een hemocytometer onder een helderveldmicroscoop en pas de celconcentratie aan op twee keer 10 tot de macht van zes cellen per milliliter. Pellet de cellen in buisjes van 1,5 milliliter door gedurende vijf minuten te centrifugeren bij 650 G en suspendeer de celpellet opnieuw in één milliliter FACS-buffer. Voeg anti-CD 16- of 32-antilichaam toe in een verdunning van één tot 200 om niet-specifieke FC-receptorbinding te blokkeren.

Na het incuberen van de cellen gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius, kleurt u de cellen met aqua levende/dode kleurstof en een voorgeconjugeerde antilichaamcocktail, waaronder CD45 E 450, CD11 B PE SI7, HCD59 PE en F4/80 BV 605. Voeg de antilichaamcocktail rechtstreeks toe aan de celsuspensie. Incubeer het monster gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius in het donker om fluoroforen te beschermen.

Was de cellen vervolgens twee keer met FACS-buffer. Fixeer de cellen in 1%paraformaldehyde gedurende 30 minuten op ijs. Was de cellen vervolgens twee keer met FACS-buffer om het resterende fixeermiddel te verwijderen.

Verkrijg gekleurde en gefixeerde cellen met behulp van een flowcytometer. Analyseer de gegevens met behulp van de software. Identificeer nier- en andere weefselresidente macrofagen en microglia met behulp van de markers CD45, CD11B en F4/80.

Voer initiële gating uit om live cellen te selecteren met behulp van voorwaartse en zijwaartse verstrooiingsprofielen. Elimineer doubletten met behulp van voorwaarts verstrooiingsgebied versus hoogtegating. Sluit dode cellen uit met behulp van de kleurstof voor levensvatbaarheid.

Verrijk immuuncellen door af te schermen op CD45-positieve populaties. Definieer nierresidente macrofagen als CD11b+F4/80hi-cellen binnen de CD45-positieve poort, zoals weergegeven in de gating-strategie. Definieer microgliapopulaties als CD11b+CD45-intermediaire cellen en voer de uiteindelijke analyse uit.

Een enkele prominente eiwitband werd waargenomen in de buurt van 54 kilodalton in de SDS-paginagel, wat de zuiverheid en het verwachte molecuulgewicht van recombinant intermedialysine bevestigt. Gezuiverd intermediair vertoonde een sterke hemolytische activiteit op een dosisafhankelijke manier, waarbij 50% lysis van rode bloedcellen werd bereikt bij 7,24 nanogram per milliliter en bijna volledige lysis bij 650 nanogram per milliliter. Flowcytometrie-analyse bevestigde succesvolle en selectieve depletie van renale macrofagen bij induceerbare humane CD59 compound cre-R-muizen één dag na toediening van intermedialysine, zonder depletie bij controlemuizen.

Renale macrofagen begonnen zich op dag drie opnieuw te bevolken en herstelden zich op dag zeven tot ongeveer 88% van hun oorspronkelijke populatie. Slechts 5% van de nieuw geregenereerde renale macrofagen bracht op dag zeven menselijke CD59 tot expressie, wat aangeeft dat herbevolking voornamelijk plaatsvond via rekrutering van monocyten in plaats van in situ proliferatie.