Gedragstesten voor optogenetische manipulatie van neurale circuits in Drosophila melanogaster

Ons onderzoek maakt gebruik van optogenetische hulpmiddelen om te bestuderen hoe neurale circuits in Drosophila melanogaster gedrag beheersen, zoals thermotaxis en zwangerschap. Door specifieke neuronen met licht te besturen, willen we begrijpen hoe deze circuits sensorische reacties aansturen en de besluitvorming met hoge precisie beïnvloeden. Optogenetica is een waardevolle technologie in de neurowetenschappen en biedt nauwkeurige controle van neurale activiteit met behulp van licht.

In Drosophila melanogaster maken hulpmiddelen zoals CsChrimson en GtACR2 gerichte activering en remming van neuronen mogelijk. Met deze tools kunnen onderzoekers neurale circuits manipuleren, gedrag bestuderen en sensorreacties met hoge specificiteit onderzoeken. Ons protocol biedt een eenvoudige, kosteneffectieve en reproduceerbare benadering van optogenetische manipulatie bij Drosophila.

Het maakt gebruik van in de handel verkrijgbare materialen, waardoor het toegankelijk is in laboratoria en klaslokalen met beperkte middelen. De methoden zijn ook in hoge mate aanpasbaar, waardoor aantrekkelijk en vermijdend gedrag kan worden bestudeerd met minimale technische uitdagingen. Verkrijg om te beginnen mannelijke en vrouwelijke Drosophila-vliegen, die GtACR2 tot expressie brengen in verwarmingscellen.

Lijn twee stalen platen uit op afzonderlijke kookplaten zodat hun randen samenkomen. Plaats er een plastic beschermer op en zet deze vast met tape om beweging te minimaliseren. Plaats nu een stuk wit papier op de vellenbeschermer om achtergrondruissignalen te verminderen en plaats een doorzichtige plastic hoes op het witte papier.

Snijd vervolgens een gat in de bodem van een doos van polystyreenschuim om plaats te bieden aan de camera en blauw licht, ongeveer 12 centimeter boven het experimentele oppervlak. Plaats de camera en het blauwe licht om schittering te minimaliseren en tegelijkertijd voor activering te zorgen. Stel de camera in om op te nemen met een time-lapse van één seconde, een smal veld en een resolutie van 4.000 bij 3.000 pixels.

Pas de instellingen van de kookplaat aan om een oppervlaktetemperatuur van 25 plus of min één graad Celsius en 31 plus of min één graad Celsius op de respectievelijke stalen platen te behouden. Bewaak de temperaturen van de staalplaten met behulp van een oppervlaktetemperatuursonde voor en na elke proef. Plaats vervolgens de plastic afdekking op de stalen plaat van 25 graden Celsius.

Laat nu met behulp van een vliegenzuiger voorzichtig een enkele vlieg onder het deksel los. Plaats de doos boven het experimentele gebied om zwak licht onder de 10 lux te creëren en laat de vlieg een minuut acclimatiseren. Til na de acclimatiseringsperiode de doos op en pas de plastic afdekking snel aan zodat het midden van de afdekking is uitgelijnd met de grens van de stalen plaat.

Start de proef, zet de camera aan en blauw licht bij 20 kilolux. Leg de activiteit van de vliegen gedurende twee minuten vast. Schakel na twee minuten de camera en het licht uit.

Gooi de vliegen weg met behulp van de aspirator. Verdoofd uitgehongerde mannelijke en vrouwelijke vliegen die CsChrimson tot expressie brengen in zoete-smaak receptorneuronen op ijs. Breng zeven tot 10 kleine puntjes lijm aan op een glasplaatje.

Plaats een vlieg ventrale kant naar boven op elke lijmstip en zorg ervoor dat de thorax en de vleugels contact maken met de lijm om beweging te minimaliseren. Waaier de vleugels naar elke kant uit om het kleefoppervlak te vergroten. Plaats natte papieren handdoeken in een vochtigheidsdoos en breng de dia's over naar de doos.

Na twee uur herstel plaatst u het objectglaasje onder de microscoop. Gebruik een spuit om een druppel water af te geven om de vliegen te verzadigen, waardoor door dorst veroorzaakte proboscis-extensies worden voorkomen. Houd handmatig een rode laserpointer vast en schijn rood licht op de slurf of kop van een enkele vlieg met 700 lux.

Bekijk de respons van de proboscis-extensie door de microscoop binnen een venster van 30 seconden. Na het testen van de door licht geïnduceerde proboscis-extensie, onderzoekt u de respons op 4% sucrose. Verdrijf een druppel sucrose aan het uiteinde van de spuitnaald en breng deze dicht bij de slurf van de vlieg.

Zet eerst het vliegendoolhof in elkaar voor het experiment. Plaats in donkere of weinig licht 10 mannelijke en 10 vrouwelijke vliegen met CsChrimson-expressie in de laadbuis en sluit deze aan op de wachtkamer. Kantel de lift en tik zachtjes op de buis om de vliegen in de wachtkamer te verplaatsen.

Nadat u de vliegen naar de wachtkamer hebt overgebracht, gebruikt u de lift om ze tussen de gaten van de laadbuis en de testbuis te laten zakken. Verwijder vervolgens de laadbuis. Plaats het vliegendoolhof op ongeveer 13 centimeter afstand van de rode lichtbron van 1.000 milliampère zonder het licht aan te doen.

Laat de lift zakken totdat de wachtkamer is uitgelijnd met de openingen in de reageerbuis, zodat de vliegen vrij kunnen bewegen tussen de in folie verpakte en onbedekte testbuisjes. Zet tegelijkertijd het rode licht aan op ongeveer 40 kilolux om CsChrimson te activeren. Laat de vliegen een minuut lang kiezen tussen de buis met rood licht en de gearceerde buis.

Breng na een minuut de lift omhoog tussen de gaten van de laadbuis en de testbuis. Verwijder de vliegen uit elke buis. Tel ze en noteer de aantallen.

Reinig de vliegenlift en het vliegendoolhof met gedestilleerd water na elke proef. In de blauwlicht-, optogenetische, thermotactische, positionele voorkeurstest vermeden vliegen de 31-graden-Celsius-kant onder de controleomstandigheden, terwijl in blauw licht met ATR-suppletie vliegen geen voorkeur vertoonden tussen 25 en 31 graden Celsius, wat wijst op HC-neuronremming via GtACR2-activering. Onder controleomstandigheden vertoonden vliegen een minimale proboscis-extensierespons, terwijl activering van rood licht met ATR-suppletie resulteerde in een significante proboscis-extensie, wat de activering van zoetgevoelige neuronen door CsChrimson aantoont.

In de roodlicht, optogenetische, vliegendoolhoftest vertoonden controlegroepen geen voorkeur, terwijl roodlichtactivering met ATR-suppletie ervoor zorgde dat vliegen de onbedekte buis vermeden, wat wijst op bitter voelende neuronactivering door CsChrimson.