Celvrije dot blot als een praktisch en aanpasbaar immunoassayplatform voor de detectie van antilichaamrespons in menselijke en dierlijke sera

Dit protocol demonstreert de celvrije puntbloedtechniek, een aanpasbaar, toegankelijk en betaalbaar immunoassayplatform dat is ontwikkeld als reactie op de COVID-19-pandemie. De bestaande gouden standaard immunoassay-methoden omvatten variaties van de ELISA-techniek en laterale flow-assays. Er is veel belangstelling voor de ontwikkeling van nieuwe immunoassay met behulp van technologieën zoals gesplitste gerapporteerde eiwitten, elektrochemische interfaces en colloïdale nanodeeltjes.

De uitdaging is dat de meeste immunoassays van de gouden standaard ontoegankelijk zijn voor niet-gecentraliseerde gemeenschappen vanwege de afhankelijkheid van dure en geavanceerde moleculaire componenten en apparatuur. Deze nieuwe CFDB-immunoassaytechniek kan snel worden aangepast aan opkomende uitbraken. Het maakt gebruik van basislaboratoriumapparatuur en vertrouwt volledig op moleculaire componenten die in eigen huis en in omgevingen met weinig middelen kunnen worden geproduceerd.

Verkrijg om te beginnen de eiwitsequentie uit de UniProt-database met behulp van de toetredingscode P0DTC9. Code voor het optimaliseren van de sequentie voor op ecoli gebaseerde expressie met behulp van de IDT-code op optimalisatietool. Plaats de geoptimaliseerde sequentie in een SnapGene-sjabloon voor de ruggengraat van de expressieconstructie voordat u de geoptimaliseerde sequentie voor commerciële synthese bestelt als een enkelstrengs DNA-fragment dat opnieuw in water wordt gesuspendeerd.

Voer een eerste expressietest op een schaal van vijf microliter uit door 10%PCR-product toe te voegen aan de ecoli BL21 celvrije reactie in een PCR-buisje. Incubeer de reactie zonder te schudden bij 30 graden Celsius gedurende 15 uur. Beoordeel de expressiekwaliteit van het nucleocapside-eiwit of NP-antigeen door een microliter van de celvrije reactie op een gel van 12%SDS-pagina te laden en deze over te brengen naar een nitrocellulosemembraan voor western blot.

Stel een celvrije reactie op schaal van één milliliter samen met behulp van 15 nanomolair gezuiverd lineair expressiesjabloonproduct voor de celvrije dot-blot-assay Incubeer het expressiemengsel in een conische buis van 15 milliliter met schudden bij 80 RPM gedurende 15 uur bij 30 graden Celsius. Na het beoordelen van de expressiekwaliteit met behulp van western blot en het aliquoteren van 50 microliter van het expressiemengsel, bewaart u de aliquots bij min 20 graden Celsius. Gebruik een hoofdrasterafbeelding zoals afgebeeld met een patroon van zes bij zes centimeter met 12 bij 12 cirkels, elk met een diameter van twee millimeter, ontworpen om overeen te komen met de spotting capaciteit van een plaat met 96 putjes.

Na het afdrukken van het hoofdraster, sandwicht u het bedrukte raster stevig tussen twee lagen zelfklevende PCR-plaatplafondfolie, snijdt u de sandwich op maat langs de buitenste rasterranden. Gebruik een biopsiepons van twee millimeter om elke gemarkeerde cirkel op het raster uit te hollen. Snijd een stuk nitrocellulosemembraan van 6,5 bij 6,5 centimeter, plaats het onder het hoofdrooster op een schoon oppervlak en zet het vast met plakband.

Markeer met een markeerstift de buitenste cirkelposities op het nitrocellulosemembraan die als richtlijn moeten worden gebruikt om het membraan door te snijden na het spotten van het monster. Verdun de serummonsters één tot 10 in PBS. Doseer met behulp van een micropipet in drievoud 0,4 microliter van elk monster op het nitrocellulosemembraan op vooraf bepaalde roosterposities.

Laat de gevlekte monsters 10 minuten binden en drogen bij kamertemperatuur. Haal met een pincet voorzichtig het nitrocellulosemembraan op en knip het langs de gemarkeerde buitenste cirkels. Breng het membraan over naar een petrischaaltje van 10 centimeter met 10 milliliter blokkeeroplossing.

Incubeer 30 minuten bij kamertemperatuur terwijl je zachtjes schudt bij 100 RPM. Haal de 50 microliter aliquot van het celvrije antigeenexpressiemengsel uit de vriezer en voeg deze na het ontdooien toe aan vijf milliliter blokkeeroplossing in een petrischaaltje van 10 centimeter. Breng het membraan rechtstreeks over naar deze antigeenhoudende oplossing en incubeer gedurende één uur bij kamertemperatuur, schuddend bij 100 RPM.

Spoel en was na een uur het membraan in TBST met 0,05% Tween 20. Voeg vervolgens 10 milliliter blokkeerbuffer met 10 microgram per milliliter gezuiverde SpyCatcher, twee apex, twee eiwitten toe aan het membraan en plaats het membraan in een schaal met SpyCatcher-apex. Incubeer gedurende een uur met schudden bij 100 RPM: Na het spoelen van het membraan met tris-gebufferde zoutoplossing of TBS, twee keer vijf minuten wassen in TBST, gevolgd door een laatste spoeling in TBS.

Plak en bevestig een stuk parafilm op een schoon werkoppervlak in de buurt van het blot-beeldvormingsinstrument. Verwijder overtollige vloeistof door op het membraan te tikken en met een pincet op de parafilm te plaatsen. Voeg onmiddellijk drie milliliter verbeterde chemiluminescentie of ECL-oplossing toe aan het membraan en incubeer precies 90 seconden bij kamertemperatuur.

Nadat u het membraan door de kraan hebt gedroogd, brengt u het over naar een beeldvormingsinstrument dat compatibel is met chemiluminescentie. Gebruik de beeldanalysefunctie van het instrument om spotintensiteiten te verkrijgen, inclusief voor drie lege posities op het nitrocellulosemembraan. Houd een constant meetvolume per spot aan.

Exporteer de gegevens naar een spreadsheet en zorg ervoor dat elke spotpositie correct wordt gelabeld. Bereken het gemiddelde en de standaarddeviatie van de drievoudige spotintensiteiten. Trek de achtergrond van het nitrocellulosemembraan af van alle monstermetingen.

Gebruik vervolgens de gegeven vergelijking om een afkapwaarde te verkrijgen voor de interpretatie van positieve of negatieve resultaten. Plot ten slotte de afgetrokken gegevens in een staafdiagram. Een celvrije dot blot-test werd uitgevoerd op de vooraf gekarakteriseerde commerciële menselijke Sarah, en een afbeelding van de vlek, samen met de bijbehorende signaalintensiteitsgrafiek, wordt in deze figuur weergegeven.

De celvrije dot blot-test identificeerde met succes alle negatieve controlemonsters en de meeste positieve monsters. Onafhankelijke tests van de celvrije dot blot-assay in het National Microbiology Laboratory identificeerden correct alle 12 negatieve en 12 positieve patiëntmonsters, wat de robuustheid ervan bevestigt. De celvrije dot blot-test detecteerde ook antilichaamresponsen bij met SARS-CoV-2 geïnfecteerde hamster Sarah, met positieve signalen waargenomen in 18 van de 24 monsters na infectie die vijf dagen na herinfectie werden verzameld, terwijl alle monsters vóór infectie negatief bleven.