Isolatie, fixatie en karakterisering van juveniele goudbrasemkop nierleukocyten door middel van flowcytometrie

Dit protocol standaardiseert de isolatie, fixatie en levensvatbaarheidsbeoordeling van leukocyten uit de kopnier van goudbrasem door middel van flowcytometrie, waardoor monsterverwerking met hoge doorvoer mogelijk is zonder afbreuk te doen aan de kwaliteit.

Traditionele technieken zoals handmatige celtelling met Neubauer-kamers en gekleurde bloeduitstrijkjes zijn gebruikelijk in de immunologie van vissen. Flowcytometrie wordt populair, maar de toepassing ervan in visstudies blijft beperkt. Traditionele visimmunologische methoden zijn leverintensief en vatbaar voor fouten. Onderzoek bij jonge dieren wordt beperkt door uitdagingen bij het verkrijgen van zuivere leukocyten en de noodzaak van onmiddellijke levensvatbaarheidsbeoordeling, waardoor de doorvoer van monsters wordt beperkt.

Dit protocol maakt gedetailleerde analyse van immuuncellen mogelijk door belangrijke leukocytenpopulaties te identificeren en levende van dode cellen te onderscheiden. Fixatie behoudt de levensvatbaarheid gedurende een maand, waardoor schaalbare, flexibele en efficiënte flowcytometrieworkflows mogelijk zijn.

Onze bevindingen bevorderen de immunologie van vissen door immuunmechanismen en milieueffecten op de levensvatbaarheid van cellen te onthullen, wat helpt bij de ontwikkeling van verbeterde strategieën voor ziektebeheer in de aquacultuur.

[Verteller] Om te beginnen acclimatiseren jonge goudbrasem, Sparus aurata, in recirculerende aquacultuursystemen waar water continu wordt gefilterd en gerecirculeerd om een stabiele omgeving te behouden. Zorg ervoor dat het systeem mechanische en biologische filtratie, beluchting en temperatuurregeling omvat om optimale abiotische parameters te behouden. Pas omgevingsfactoren zoals fotoperiode, temperatuur, zoutgehalte, pH en opgeloste zuurstofniveaus aan volgens de specifieke behoeften van het onderzoek. Gebruik een net om jonge goudbrasemvissen voorzichtig over te brengen in een tijdelijke bewaarcontainer gevuld met aquariumwater. Leg na het euthanaseren van de vis een vis op zijn kant op een steriele snijbak. Maak met een scalpel een voorzichtige incisie langs de ventrale middellijn van de vis van de opening naar de kieuwen. Gebruik een dissectieschaar om de incisie te verlengen en de inwendige organen bloot te leggen. Zoek de hoofdnier, die zich net achter de kieuwen in de buurt van het voorste dorsale gebied van de lichaamsholte bevindt en zich uitstrekt langs de bovenzijde onder de wervelkolom. Verwijder met een tang en schaar met een fijne punt voorzichtig de omliggende weefsels om de hoofdnier beter te visualiseren. Til vervolgens de hoofdnier op en maak er precieze sneden omheen om hem te bevrijden van de omliggende weefsels. Plaats de uitgesneden hoofdnier onmiddellijk in een celzeef die in een steriel petrischaaltje is geplaatst. Pipetteer twee milliliter Hanks' Balanced Salt Solution, of HBSS, in een steriel petrischaaltje. Macereer de uitgesneden kopnier op de celzeef met behulp van de zuiger van een spuit om de cellen in de oplossing vrij te geven. Bereid vervolgens een oplossing voor een dichtheidsgradiëntmedium. Pipetteer 600 microliter van de dichtheidsgradiëntmediumoplossing in polystyreenbuizen met ronde bodem van vijf milliliter. Breng langzaam twee milliliter celsuspensie van de petrischaal over in elke buis. Centrifugeer bij 400 g gedurende 45 minuten bij vier graden Celsius met de rem uitgeschakeld. Verwijder na het centrifugeren het buisje en observeer de leukocytenring. Gebruik vervolgens een steriele pasteurpipet om voorzichtig ongeveer 100 microliter van de leukocytenring over te brengen in een microcentrifugebuis van twee milliliter. Vul nu het volume aan tot twee milliliter met HBSS en resustriat de cellen voorzichtig. Centrifugeer het monster gedurende 10 minuten bij 400 g bij vier graden Celsius. Gooi het bovenstaande na het centrifugeren voorzichtig weg zonder de pellet op de bodem van de buis te verstoren. Resuspendeer vervolgens de gezuiverde pellet in één milliliter HBSS totdat de uiteindelijke celconcentratie tussen de 10.000 en een miljoen cellen per milliliter ligt. Voeg 50 microliter dimethylsulfoxide toe aan een injectieflacon met de reactieve kleurstof. Nadat u de celdichtheid hebt aangepast tot één miljoen cellen per milliliter, brengt u één milliliter van de celsuspensie over in microcentrifugebuisjes van twee milliliter. Bereid de monsters van de levensvatbaarheidscontrole voor zoals gegeven. Induceer celdood in buisjes drie en vier door ze zeven minuten in een waterbad van 70 graden Celsius te plaatsen. Om de cellen te kleuren, pipetteert u een microliter van de gereconstitueerde fluorescerende kleurstof in buisjes twee en vier met een milliliter celsuspensie en mengt u goed. Incubeer de gekleurde buisjes 30 minuten bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht. Was de cellen vervolgens twee keer met een milliliter HBSS en suspendeer de laatste pellet opnieuw in 900 microliter van dezelfde buffer. Piket vervolgens 100 microliter 37% formaldehyde om de cellen te fixeren en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Na de cellen twee keer te hebben gewassen met één milliliter HBSS met 1% BSA, suspendeer opnieuw in één milliliter van dezelfde oplossing. Bewaar de monsters bij vier graden Celsius in de koelkast voor maximaal een maand. Plaats de vaste monsterbuis in de monsterpoort van de flowcytometer voor analyse. Noteer minimaal 10.000 gebeurtenissen voor elke steekproef binnen de singletspoort. Sla alle gegevens op en maak er een back-up van op externe schijven of cloudopslag. Visualiseer de flowcytometriegegevens door het voorwaartse verstrooiingsgebied versus het zijverstrooiingsgebied uit te zetten om de celgrootte en granulariteit te beoordelen. Voer singlet-celpoorten uit en sluit veelvouden uit door het voorwaartse spreidingsgebied verus de voorwaartse verstrooiingshoogte uit te zetten. Identificeer de drie leukocytenpopulaties op basis van voorwaartse versus zijwaartse verstrooiingsprofielen. Stel de drempel in voor levensvatbare kleurstofkleuring in het overeenkomstige fluorescentiekanaal om levende en dode cellen te onderscheiden. Onder optimale omstandigheden vormden lymfocyten, monocyten en granulocyten respectievelijk 31%, 38% en 31% van de leukocytenpopulatie, terwijl onder thermische stress lymfocyten daalden tot 21,3%, monocyten stegen tot 45,6% en granulocyten stabiel bleven op 33,1%. Het monster dat aan optimale omstandigheden werd blootgesteld, vertoonde een hogere levensvatbaarheid, met een overwicht van levende cellen in alle leukocytenpopulaties. Daarentegen vertoonde de thermisch gestreste steekproef een significante toename van celdood.