Een elektroporatiecytometrieprotocol voor live-cell, fluorescentiemicroscopie met behulp van U2 OS-celcultuur

De reikwijdte van dit onderzoek richt zich op het effect van gepulseerde elektrische velden op celgedrag, met name hoe elektroporatie de celcyclus beïnvloedt.

Het belangrijkste voordeel van dit protocol is de mogelijkheid om tot 72 uur lang continu experimenten met levende celelektroporatie uit te voeren met behulp van celcultuur van zoogdieren. Ons laboratorium is gericht op het aanpassen van deze technieken voor microfluïdica, wat zorgt voor kleinere monstergroottes, verminderde reagensvereisten en betere monstercontrole voor toekomstige protocollen.

[Verteller] Kweek om te beginnen U2OS FUCCI CA5-cellen in een plaat van 10 centimeter met 10 milliliter DMEM hoge glucose met 10% FBS en 1% penicilline-streptomycine. Incubeer de plaat bij 37 graden Celsius in een omgeving met 5% koolstofdioxide. Wanneer de cultuur 80% samenvloeiing bereikt, aspireert u de media van de plaat. Was de cellen met PBS, voeg vervolgens een milliliter 0,25% trypsine toe en incubeer gedurende 1,5 minuut om de cellen te dissociëren. Neutraliseer de trypsine door de gedissocieerde cellen te suspenderen in vijf milliliter DMEM hoge glucose. Verkrijg een monster van 100 microliter uit de geresuspendeerde cultuur en plaats het op de onderste glazen afdekking in de kamer van het elektroporatiecytometriesysteem. Zorg ervoor dat de kamer voor 30% samenvloeit na het inbrengen van het monster. Voeg langzaam vier milliliter DMEM hoge glucose toe aan het uiteinde van de kamer, om te voorkomen dat de vloeistof het monster wegspoelt. Plaats een standaard microscoopglaasje over de kamer en incubeer de kamer gedurende 24 uur bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Schakel de omgekeerde fluorescerende microscoop in met een omgevingscontrolekamer om het systeem te laten stabiliseren voordat het wordt geëlektroporeerd. Terwijl de omgevingskamer stabiliseert, gebruikt u krokodillenklemkabels om een digitale multimeter aan te sluiten op de pulsgeneratorcondensator en de hoogspanningsschakelaar voor een snelle installatie met de elektroporatiekamer. Selecteer nu een vergroting van 20x op de microscoop. Zorg er in de microscoopsoftware voor dat FITC/GFP- en A594 Texas Red M Cherry-kanalen zijn geselecteerd die overeenkomen met de twee fluorescerende eiwitten in het FUCCI CA5-systeem. Gebruik lage belichtingsinstellingen, meestal minder dan 0,05 seconden, om fotoschade tijdens langdurige beeldvorming te voorkomen. Maak testfoto's om de focus en kwaliteit van het beeld te optimaliseren voordat u met time-lapse-beeldvorming begint. Programmeer de time-lapse om gedurende een periode van 24 uur elke 10 minuten beelden vast te leggen vanuit drie tot zes verschillende gezichtspunten om een grote hoeveelheid celcyclusgegevens per time-lapse te verkrijgen en tegelijkertijd fotoschade te beperken. Zorg ervoor dat autofocus is ingeschakeld voor het A594-kanaal om het volgen van cultuur tijdens de time-lapse te optimaliseren. Laat de software open totdat de elektroporatie is voltooid. Plaats de elektroporatiecytometriekamer in de microscoop die is uitgerust met een geschikte omgevingskamer. Houd de kamer vóór elektroporatie gesloten en zorg ervoor dat het omgevingssysteem blijft draaien om de juiste celcyclusomstandigheden te behouden. Open de milieukamer en bevestig een digitale multimeter aan de pulsgenerator en sluit vervolgens met behulp van krokodillenklemkabels de pulsgenerator aan op de kamerelektroden. Laad de condensator van de pulsgenerator op tot 180 volt. Ontlaad de puls snel in de kamer totdat de digitale multimeter nul volt aangeeft. Verwijder alle elektrische aansluitingen van de kamer en plaats het kamerdeksel onmiddellijk terug om optimale kweekomstandigheden te garanderen. Activeer de time-lapse-beeldvorming onmiddellijk zodra de omgevingskamer stevig op zijn plaats zit. Nadat de time-lapse is voltooid, gebruikt u de microscoopsoftware om alle vastgelegde beelden op te slaan als één video. Pas de visuele kwaliteit aan om de helderheid van celfuncties te verbeteren voor handmatige kwantificering. Observeer ten slotte de veranderingen in FITC- en A594-signalen in de loop van de tijd om celfasen in de time-lapse-video te volgen. Met behulp van het Fuji-systeem werden visuele gegevens verzameld door kleurveranderingen te volgen die verband hielden met eiwitexpressie en ubiquitinatie, waardoor een duidelijk onderscheid tussen G1-, S-, G2- en M-fasen mogelijk was. Dit maakte directe observatie van de voortgang van de celcyclus onder verschillende omstandigheden mogelijk. Deze figuur geeft een samenvatting van de belangrijkste gegevens die zijn verzameld uit twee reeksen experimenten met behulp van niet-gesynchroniseerde en S-fase gesynchroniseerde celculturen. Blootstelling aan gepulseerde elektrische velden in niet-gesynchroniseerde cellen verhoogde de gemiddelde lengte van de G1-, G2- en M-fasen aanzienlijk, terwijl de S-fase ongewijzigd bleef. In gesynchroniseerde cellen leidde blootstelling aan gepulseerde elektrische velden tot een kortere duur van G1-, S- en G2-fasen, hoewel alleen S en G2 statistisch significant waren, terwijl de M-fase onaangetast bleef.