Chemogenetische regulatie in geherprogrammeerde stamcel-afgeleide voorlopercellen bij de behandeling van neurodegeneratieve ziekten

Ons onderzoek richt zich op het illustreren van het pathogene mechanisme dat ten grondslag ligt aan neurodegeneratieve ziekten, terwijl we geavanceerde technologieën integreren om effectieve celtherapietechnieken voor klinische toepassingen te ontwikkelen. Ons recente werk transplanteerde chemogenetisch gemodificeerde stamcellen in muismodellen voor de ziekte van Parkinson. We moduleren de neuronactiviteiten van één cel met designerdrugs, dus elektrofysiologische monitoring en gedragsevaluatie. We gebruiken CRISPR voornamelijk voor genetische manipulatie, elektrofysiologie om neurale activiteit te monitoren en gedragstest om functieherstel in modellen voor de ziekte van Parkinson te evalueren. De efficiëntie van transplantaatcellen neemt toe bij de juiste indicatie, overleving en functionele bijdrage aan het gastheerweefsel bij op stamcellen gebaseerde therapie, voor de behandeling van neurodegeneratieve ziekten. Ongecontroleerde cellulaire activiteit gerelateerd aan negatieve gevolgen, waaronder tumorgenese.

Door gebruik te maken van technologie in menselijke geherprogrammeerde stamcellen en driverneuronen worden de middelen geboden om neuronale activiteiten nauwkeurig te controleren via toediening van het designermedicijn CNO.

[Docent] Meng om te beginnen voorzichtig 50 tot 100 nanogram van de gelineariseerde vector, fragmenteer één en fragmenteer twee, in een verhouding van één tot drie tot drie molaire, samen met 2x kloonmix. Incubeer het mengsel gedurende een uur bij 55 graden Celsius om homologe recombinatie te vergemakkelijken met behulp van Gibson-assemblage. Plaats het gids-RNA gericht op de AAVS1-site in de BBS1-site van de PX458-vector. Onderhoud de geherprogrammeerde stamcellen in kweekmedia, waarbij wordt gestreefd naar een celdichtheid tussen twee en 5 miljoen cellen per milliliter. Meng nu twee tot 5 miljoen cellen, twee microgram van elk donorplasmide en twee microgram GRNA-plasmide in 100 microliter elektroporatiebuffer. Breng het cel- en plasmidemengsel over in een cuvet om elektroporatie uit te voeren. Breng vervolgens de geëlektroporeerde cellen over in platen met zes putjes die zijn gecoat met poly-D-lysine en laminine. Verdeel ongeveer 500.000 cellen per putje in twee milliliter kweekmedium. Gebruik na 72 uur elektroporatie een flowcytometer om fluorescerende positieve cellen te sorteren. Configureer de sorteerder met het FITC-kanaal voor ZsGreen-detectie. Neem onbehandelde geïnduceerde neurale stamcellen op als negatieve controles om de basisfluorescentie te definiëren. Plaat enkele ZsGreen-positieve cellen in platen met 96 putjes die vooraf zijn gecoat met poly-D-lysine en laminine en voeg 200 microliter kweekmedium per putje toe. Houd de cultuur zeven tot 14 dagen in stand. Isoleer enkele klonen die fluorescentie vertonen met behulp van een omgekeerde fluorescentiemicroscoop die is uitgerust met een groene fluorescerende eiwitfilterset. Na het uitbreiden van de positieve cellen op gecoate platen met 48 putjes, splitst u ze in twee delen, een voor voortgezette kweek en de andere voor genotypering. Extraheer genomisch DNA uit de kandidaat-klonen. Bereid een PCR-mengsel voor met behulp van twee hoofdreparaties, één om de insertie van het betreffende gen te bevestigen en een andere om onderscheid te maken tussen homozygote en heterozygote klonen. Verwerk de cellen, was ze in PBS en centrifugeer gedurende drie minuten op 250 G. Voer eenzijdige stereotactische injecties uit van drie microliter 6-hydroxydopamine met een concentratie van vijf microgram per microliter op het verdoofde dier. Richt je op het juiste corpus striatum met behulp van de juiste coördinaten. Dien vier weken na de operatie een intraperitoneale injectie met apomorfine toe van één milligram per kilogram met behulp van een oplossing van 0,5 milligram per milliliter opgelost in zoutoplossing om de laesies te valideren. Dien een stereotactische injectie van vier microliter van de bereide celsuspensie toe in het muismodel van de ziekte van Parkinson. Voer de cilindertest uit op meerdere tijdstippen na celtransplantatie. Plaats een glazen beker met een diameter van 20 centimeter en een hoogte van 30 centimeter op een vlakke, niet-reflecterende ondergrond. Plaats vervolgens een camera met bovenaanzicht boven de cilinder om de volledige diameter vast te leggen. Plaats elke muis in het midden van de cilinder en start gelijktijdige video-opname gedurende drie minuten per sessie. Na de sessie brengt u de muis terug naar zijn thuiskooi. Beoordeel de beweging van de bovenste ledematen van de muizen tijdens de sessie van drie minuten. Bereken het aantal wandcontacten van de gehandicapte voorpoot ten opzichte van het totale aantal contacten van beide voorpoten. Dien zoutoplossing of clozapine N-oxide toe in een dosering van 1,2 milligram per kilogram via intraperitoneale injectie. Voer de cilindertest opnieuw uit om gedragsmodulatie in het muismodel van de ziekte van Parkinson te beoordelen na toediening van clozapine N-oxide. Nadat je de hersenen uit het verdoofde dier hebt gehaald, plaats je het onmiddellijk in ijskoude kunstmatige hersenvloeistof op basis van sucrose om de cellulaire integriteit te behouden Gebruik een vibratoom om de hersenen in secties van 300 tot 400 micrometer dikte te snijden. Pas de instellingen voor gasinvoer aan om in evenwicht te zijn met 95% zuurstof en 5% koolstofdioxide bij 34 graden Celsius. Breng de hersenplakjes over naar een kamer gevuld met kunstmatig hersenvocht. Laad glazen pipetten met een bevroren intracellulaire oplossing en zorg ervoor dat de elektrodeweerstand tussen zeven en 10 megohm ligt. Monteer plakjes in een ondergedompelde opnamekamer die met twee milliliter per minuut is oververhit met zuurstofrijk kunstmatig hersenvocht bij 34 graden Celsius. Plaats pipetten met behulp van gemotoriseerde micromanipulatoren onder infrarood differentiële interferentiecontrastmicroscopie. Breng de hele celconfiguratie tot stand met behulp van zachte zuigkracht om neuronen met een weerstand van meer dan één gigaohm te patchen. Klem de cellen vast op min 70 millivolt met behulp van een patchklemversterker en verkrijg gedurende acht minuten spontane excitatoire postsynaptische stromen bij een bemonsteringsfrequentie van 10 kilohertz. Voeg direct na de nulmeting 50 micromolair clozapine N-oxide toe aan de registratiekamer. Ga door met het registreren van gegevens gedurende 16 minuten en controleer veranderingen in spontane excitatoire postsynaptische stroomfrequentie of amplitude. Voer ten slotte een wash-outprocedure uit door de clozapine N-oxideoplossing te vervangen door vers kunstmatig hersenvocht en ga door met registreren om het herstel van de synaptische activiteit te evalueren. Hemogenetische modulatie met behulp van clozapine N-oxide verminderde de contralaterale beweging van de voorpoot bij hM4Di-getransplanteerde muizen en verhoogde deze bij hM3Dq-getransplanteerde muizen in vergelijking met behandeling met zoutoplossing, wat bidirectionele gedragscontrole aantoont. Elektrofysiologische opnames toonden aan dat hM4Di-getransplanteerde cellen langere intervallen en kleinere piekamplitudes hadden in spontane excitatoire postsynaptische stromen, terwijl hM3Dq getransplanteerde cellen kortere intervallen en grotere amplitudes hadden, wat wijst op respectievelijke onderdrukking en versterking van synaptische activiteit. Immunofluorescentieanalyse bevestigde de in vivo expressie van tyrosinehydroxylase en ZsGreen in de getransplanteerde hM4Di- en hM3Dq-cellen, wat een succesvolle integratie van het transplantaat ondersteunt.