Bioreactorassemblage voor continue cultuur van complexe fecale gemeenschappen

We bestuderen de interacties tussen gastheerbacteriën en hoe intrinsieke en extrinsieke factoren de gezondheid beïnvloeden, met de nadruk op bacteriële effecten op de ontwikkeling, progressie en behandelingsrespons van kanker. We bestudeerden anti-PD-1 immuuncheckpointremmers in bacteriële gemeenschappen, waarbij we ontdekten dat bacteriële metabolieten de werkzaamheid van de anti-PD-1-therapie verbeteren.

Het isoleren van de impact van gastheerfactoren op het microbioom in vivo is een uitdaging vanwege meerdere invloeden. De microbioreactor-array maakt gecontroleerd onderzoek van specifieke processen mogelijk, waardoor hun directe effecten op microbiële gemeenschappen worden verduidelijkt. Dit protocol biedt een kosteneffectieve methode om fecale gemeenschappen onder gecontroleerde omstandigheden te cultiveren, terwijl onderzoekers relatief snel parallel experimenten kunnen uitvoeren.

[Docent] Zorg om te beginnen voor een 3D-geprinte reactorarray met zes putjes. Knip twaalf stroken van 25 millimeter uit 1/8 inch PTFE-slang en gebruik een scheermes om de uiteinden te scheren. Steek het ene uiteinde van elke strip in de schroefdraadopening van een mannelijke Luer met een 25 tot 28-draads fitting. Schroef de fittingen stevig in de daarvoor bestemde afval- en monsteropeningen van de array. Steek nu een microroerstaaf in elke reactorput. Schroef een mannelijke 1/4-28 schroefdraadfitting in de brongaten van elke reactorput. Schroef vrouwelijke Luer-slangstangadapterfittingen in de schroefdraadfittingen voor de afval- en bronaansluitingen van elke reactorput. Schroef vervolgens de vrouwelijke Luer X naar 3-32/2-inch slangpilaaradapterfittingen in de 1/4-28 schroefdraadfittingen voor de monsterpoorten. Plaats een rubberen septum over de slangpilaaradapters en vouw de bovenkant om. Snijd vervolgens twee sets E-LFL 2,06 millimeter slang af voor de afval- en bronleidingen. Gebruik heet water om de slang zachter te maken voor eenvoudigere bevestiging. Bevestig de slang aan de vrouwelijke Luer X naar 1/8 inch slangpilaaradapterfittingen voor de bron- en afvalaansluitingen. Bevestig nu een mannelijke Luer met een borgring X naar 1/8 inch slangpilaaradapter aan het andere uiteinde van de slang. Schroef er een female Luer X naar 1/16th inch slang barb adapter in vast. Sluit de juiste maat tweestopslang aan op de bijbehorende bron- en afvoeraansluitingen. Bevestig vervolgens een andere vrouwelijke Luer X naar 1/16e inch slangpilaar adapterfitting aan het andere uiteinde van de slang. Nadat u dit voor alle bron- en afvalfittingen hebt herhaald, plaatst u een mannelijke Luer met borgring X naar 1/8 inch slangpilaaradapterfittingen op een stuk E-LFL 2-buis. Bevestig het ene uiteinde aan de onbezette vrouwelijke Luer X naar 1/16e inch slangpilaaradapter aan het einde van elk twee-stop buisgedeelte voor alle stukken. Nadat u dit voor alle bron- en afvalfittingen hebt herhaald, sluit u de E-LFL 2,06 millimeter slang aan voor de bronleidingen van reactorputten één en twee, met behulp van tegenovergestelde uiteinden van een vrouwelijke Luer T. Bevestig vervolgens een stuk slang van vijf centimeter met mannelijke Luer met borgring X naar 1/8 inch adapterfittingen aan elk uiteinde aan de middelste uitlaat van de T, die leidt naar een tweede T-splitsing. Sluit nu de E-LFL 2.06 millimeter bronslang voor de derde reactor aan op de andere kant van de tweede T. Bevestig nog een buissegment van vijf centimeter met een mannelijke Luer met borgring X naar 1/8 inch adapter aan het ene uiteinde en een vrouwelijke Luer met borgring X naar 1/8 inch adapter aan het andere uiteinde. Bevestig vervolgens een mannelijke Luer met borgring X naar 1/8 inch slangpilaaradapter aan het ene uiteinde van een stuk E-LFL 2.06 millimeter slang van 25 centimeter. Bevestig een vrouwelijke Luer X naar 1/8 inch slangpilaaradapter aan het andere uiteinde en sluit deze af met aluminiumfolie. Om de afvalinzamelfles in elkaar te zetten, bevestigt u losjes een dop met twee gaten op een fles van twee liter. Steek de mannelijke 1/4-28 schroefdraadfittingen in beide gaten van de dop. Bevestig vervolgens een female Luer met 1/8 inch slangpilaaradapter aan de buitendraadfitting die niet aansluit op de voorgemonteerde PTFE slang in de dop. Sluit een stuk E-LFL slang van 2.06 millimeter van vijf centimeter aan op de slangpilaaradapter op de fles. Bevestig een mannelijke Luer met borgring X naar 1/8 inch slangpilaaradapter aan het andere uiteinde van de slang voordat u deze met folie bedekt. Bedek ten slotte de hele dop van de fles met aluminiumfolie voordat u gedurende 45 minuten autoclaveert op 121 graden Celsius en 15 psi. Zodra het autoclaveren is voltooid, draait u de fittingen en folieafdichtingen vast en plaatst u de reactoren 48 uur voor gebruik in een anaërobe kamer. Lijn de reactorarray in de anaërobe kamer uit over een magnetische roerplaat die is ingesteld op 1.600 RPM. Monteer vervolgens de tweestopslang voor zowel de bron- als de afvoerleiding in de klemmen op de bijbehorende slangenpompen. Vergrendel de klemmen op hun plaats als dit minder dan 25 uur voor gebruik gebeurt. Laat het anders los om de slijtage van de slang te verminderen. Verwijder nu de foliedop van de bronfles. Schroef de fittingen in de mannelijke Luer op 1/4-28 schroefdraadfittingen en zorg ervoor dat deze openingen zijn aangesloten op de interne PTFE-slang. Verwijder de foliedoppen en bevestig een spuitfilter van 0.22 micrometer op de ontluchtingsleiding van vijf centimeter van zowel de bronfles als de afvalfles. Begin de stroom met een gematigde snelheid om te beginnen met het vullen van de reactor. Zorg ervoor dat de tailleslang in elke reactorput lager is geplaatst dan de bronslang om overvulling of het volledig legen van elke put te voorkomen. Als de reactoren zich beginnen te vullen, controleert u of alle putten hetzelfde volume bereiken en of de media in de taille stromen voordat u de reactoren een nacht laat ontgassen. Begin met het overbrengen van de experimentele materialen naar de anaërobe kamer gedurende 24 uur. Nadat u de benodigde hoeveelheid fecaal inoculum hebt berekend, brengt u de geconserveerde fecale monsters in cryogene flesjes over in de anaërobe kamer en laat u ze 15 minuten ontdooien. Breng met een pipetpunt met brede boring het fecale materiaal over van cryogene injectieflacons in een conische buis van 50 milliliter. Centrifugeer de afgesloten buis gedurende vijf minuten bij 200 g om de deeltjes te laten bezinken. Breng de buisjes terug in de anaërobe kamer. Verwijder vervolgens de supernatant. Gebruik een autoclaaf laboratoriumspatel om de 5,7 gram van de fecale vaste stoffen over te brengen in een nieuwe conische buis van 50 milliliter. Voeg 17,1 milliliter anaërobe steriele zoutoplossing toe aan de buis en sluit deze goed af. Draai de buis nu vijf minuten voordat u gaat centrifugeren, zoals eerder gedemonstreerd. Gebruik een laboratoriumdoekje met 10% bleekmiddel om de septa bovenop elke reactor gedurende ten minste twee minuten te steriliseren. Nadat de monsters zijn teruggebracht naar de anaërobe kamer, pipeteert u het bovenstaande uit in nieuwe conische buisjes van 50 milliliter. Breng nu 3,8 milliliter fecale slurry-supernatans over in zes afzonderlijke spuiten van vijf milliliter die zijn uitgerust met 16-gauge naalden van 1,5 inch. Verwijder het bleekdoekje van de reactorsepta. Steek vervolgens de naald door het septum en injecteer langzaam 3,8 milliliter fecale slurry in elke reactor voordat u de reactoren een nacht laat staan. Na een incubatie van 16 tot 18 uur start u de stroom naar de reactor. Zet de magnetische roerplaat direct na het injecteren van de fecale suspensie op maximale snelheid. De samenstelling van de microbiële gemeenschap in beide replicatiereactoren veranderde in de loop van de tijd, waarbij verschillende soorten een variabele relatieve abundantie over de dagen vertoonden. Kieskeurige anaërobe bacteriën, zoals Clostridium-geslachten, werden consequent gedetecteerd in elke reactor op alle tijdstippen.