Een gestroomlijnde aanpak voor proteomics op basis van massaspectrometrie met behulp van geselecteerde weefselregio's

We hebben een gestroomlijnde methode ontwikkeld voor het bestuderen van het proteoom in specifieke regio's van hogere weefselmonsters met behulp van massaspectrometrie. Ons doel is om de proteomische techniek te verbeteren, inclusief monstervoorbereiding en massaspectrometrie-analyse, om een hoge nauwkeurigheid en betrouwbaarheid te bereiken. Een uitdaging bij op FFPE gebaseerde ruimtelijke proteomics is onvolledige eiwitvertering, waardoor de algehele eiwitdekking afneemt.

Om deze te overwinnen zijn geoptimaliseerde spijsverteringsprotocollen en verbeterde massaspectrometriestrategieën nodig om de diepte en nauwkeurigheid van proteoom te verbeteren. We identificeerden verschillende eiwitveranderingen bij verschillende soorten pancreasaandoeningen, wat inzicht geeft in de verschillen tussen goedaardige en precancereuze aandoeningen. Deze bevindingen kunnen helpen bij de vroege diagnose van alvleesklierkanker.

We streven ernaar de proteïnasemethode van de patiënt te bevorderen om eiwitmapping met hoge resolutie in weefselregio's te bereiken. Door gebruik te maken van op massaspectrometrie gebaseerde proteomics, proberen we regiospecifieke moleculaire handtekeningen te identificeren die bijdragen aan de ontdekking van biomarkers. Onze aanpak integreert die patiëntattributen en pre-voorbereiding met gegevensonafhankelijke gelegenheidsmassaspectrometrie om snel hoogwaardige proteoomgegevens te genereren uit geselecteerde FFPE-weefselregio's.

Deze methode maakt een grote kwantificering van het ruimtelijke proteoom mogelijk. Bereid om te beginnen een met hematoxyline en eosine bevlekt of immunohistochemisch gekleurd weefselglaasje voor met het interessegebied aangegeven door een patholoog. Plaats het niet-gekleurde weefselglaasje en het bevlekte weefsel schuif heen en weer en zorg voor een goede uitlijning.

Verwijder met een scalpel weefselgebieden die niet interessant zijn en schraap de weefselgebieden die van belang zijn naar het midden van de objectglaasje. Breng het verzamelde weefsel over in een schone 1,5 milliliter eiwitarme bindbuis en voeg 180 microliter SDS-lysisbuffer toe aan elke buis. Voer sondesonicatie uit met een amplitude van 20% gedurende 10 cycli van vijf seconden aan en vijf seconden uit.

Incubeer de monsters nu 3,5 uur bij 100 graden Celsius met behoud van een snelheid van 1.000 G. Laat het monster na de incubatie 10 minuten afkoelen tot kamertemperatuur. Centrifugeer vervolgens bij 16.000 G gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur om weefselresten van het bovenstaande te scheiden. Verzamel het bovenstaande in een schoon geëtiketteerde tube en bewaar het bij min 80 graden Celsius tot verder gebruik.

Voor acetonprecipitatie plaatst u het eiwitmonster dat overeenkomt met 100 tot 300 microgram in een acetoncompatibele buis. Voeg vervolgens ijskoude aceton toe, voorgekoeld tot min 20 graden Celsius, in een volume dat vijf keer het monstervolume is. Incubeer het mengsel gedurende 18 uur bij min 20 graden Celsius.

Centrifugeer de buis na incubatie gedurende 16.000 minuten bij 15 G. Gooi het bovenstaande voorzichtig weg zonder de eiwitkorrel te verstoren. Voeg 500 microliter aceton toe, getemperd op min 20 graden Celsius en centrifugeer.

Na het decanteren van het supernatant, laat u het monster aan de lucht drogen. Bereid de lysisbuffer voor suspensievang voor in gedeïoniseerd water. Voeg vervolgens 40 microliter van de voorbereide buffer toe aan de monsterbuis en draai grondig om de aan de lucht gedroogde eiwitpellet op te lossen.

Plaats het monster gedurende 35 minuten in een schudbroedmachine bij 100 graden Celsius bij 1.000 G. Voeg vervolgens 10 microliter van het alkylerende reagens toe aan het monster en incubeer het monster gedurende een uur bij kamertemperatuur bij 300 G. Voeg in een chemische zuurkast vijf microliter van het 10% trichloorazijnzuur toe aan het monster, waardoor het totale volume 55 microliter wordt.

Controleer de pH van het monster met pH-papier om er zeker van te zijn dat deze lager is dan één. Voeg vervolgens 350 microliter bindingsbuffer één toe aan het monster om eiwitten op te vangen. Plaats de suspensievangkolom in een buis van twee milliliter en breng het hele monster, inclusief onoplosbaar materiaal, over in de kolom.

Centrifugeer de kolom bij 4.000 G gedurende 50 seconden om eiwitten op te vangen. Voeg vervolgens 400 microliter wasbuffer twee toe. Gooi de doorstroming na het centrifugeren weg.

Na de laatste wasbeurt centrifugeert u de kolom gedurende 1,25 minuten op 4.000 G om ervoor te zorgen dat buffer één volledig wordt gepasseerd. Voeg 125 microliter digestiebuffer toe aan de suspensievangkolom en sluit deze af om verdamping te voorkomen. Incubeer het monster gedurende 18 uur bij 37 graden Celsius zonder te schudden.

Voeg nu 80 microliter elutiebuffer één toe aan de suspensievangkolom en centrifugeer gedurende 1,25 minuten op 4.000 G. Trek aan de geëlueerde peptiden en breng ze over in een schone nieuwe buis. Na peptidekwantificering 20 microgram peptiden lyofiliseren.

Los de gevriesdroogde peptiden opnieuw op in 40 microliter waterige buffer met 3% acetonitril in 0,1% mierenzuur water en soniceer gedurende 10 minuten in een sonicatiebad. Centrifugeer het monster bij 16.000 G gedurende 60 minuten en breng het bovenstaande over in flesjes voor massaspectrometrie-analyse. Injecteer twee microliter van elk monster met behulp van de autosampler van het massaspectrometriesysteem voor nano-vloeistofchromatografie.

Afzonderlijke peptiden op een omgekeerde fasekolom gevuld met drie micrometer C18-materiaal met een gradiënt van 127 minuten van vijf tot 35% acetonitril bij 100 nanoliter per minuut. Ioniseer de peptiden via een nanospray-ionenbron en breng ze over naar een op Orbitrap gebaseerde massaspectrometer. Analyseer peptiden met behulp van een data-onafhankelijke acquisitiemethode met een smal bereik.

Nauwkeurige isolatie van het interessegebied tijdens de verwerking van FFPE-weefsel werd bereikt in verschillende in pancreas cystische formaline gefixeerde, in paraffine ingebedde weefsels. Reproduceerbare totale ionenchromatogrammen werden verkregen tussen biologische trireplicaten voor elk type cystisch neoplasma van de pancreas. Vloeistofchromatografie massaspectrometrie-analyse identificeerde 9.703 eiwitten.

De abundanties van alle geïdentificeerde eiwitten besloegen 6,25 ordes van grootte, wat een uitgebreide proteoomdekking aantoont, en bekende eiwitmarkers voor alvleesklierkanker werden gekwantificeerd. In totaal werden 933 differentieel tot expressie gebrachte eiwitten geïdentificeerd, waarvan 457 opgereguleerd en 476 gedownreguleerd in intraductale papillaire mucineuze neoplasmata. Bio-informaticaanalyse toonde aan dat differentieel tot expressie gebrachte eiwitten geassocieerd waren met verschillende aan alvleesklierkanker gerelateerde routes.