Generatie en karakterisering van door mensen geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide astrocyten zonder fragiel X-boodschapperribonucleoproteïne

Dit werk richt zich op vier hersenspecifieke menselijke astrocyten en hoe deze worden veranderd door neurologische ontwikkelingsstoornissen zoals het fragiele X-syndroom. Eerder werk gebruikte diermodellen om voornamelijk neuronen te bestuderen, dus dit werk voegt een nieuwe dimensie toe aan dit onderzoeksgebied.

Mechanistische inzichten uit dierstudies hebben weinig klinisch succes gehad. De grote uitdaging is om vergelijkbare inzichten te krijgen in neuronen en astrocyten van menselijke oorsprong.

Ons protocol heeft met succes functionele voor windspecifieke astrocyten gegenereerd, die een ontregeld, glycolytisch en mitochondriaal metabolisme vertonen bij het fragiele X-syndroom, waardoor onderzoek naar de rol van gliacellen in de ziektebiologie mogelijk is. Ondanks groeiend bewijs over de sleutelrol van glia in de neuronale functie bij gezondheid en ziekte, is er weinig bekend over hoe menselijke astrocyten worden beïnvloed bij neurologische ontwikkelingsstoornissen, zoals het fragiele X-syndroom.

Vooruitkijkend zullen we voortbouwen op dit raamwerk om te bestuderen hoe astrocyten en hun interacties met neuronen worden veranderd door ziekte, en vervolgens hoe deze kunnen worden gecorrigeerd door therapeutische interventies.

[Docent] Smeer om te beginnen een schaal met zes zwellingen in met Matrigel verdund in een verhouding van één tot 60 in geavanceerde DMMF 12. Bewaar de gecoate schaal bij een temperatuur van twee tot acht graden Celsius. Verwijder op de dag van het kweken het coatingmateriaal van de schaal en voeg een milliliter compleet essential eight medium toe, samen met een gesteenteremmer in een uiteindelijke concentratie van één X. Plaats de schaal in een broedmachine. Instellen op 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide voordat de door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen, of IPSC's, worden toegevoegd. Zaai de menselijke IPSC's in een compleet essentieel acht-medium met de gesteenteremmer in een uiteindelijke concentratie van één X om de hechting van de kolonie te verbeteren. Vervang de volgende dag het complete essential eight medium door vers medium, zonder de gesteenteremmer. Ga door met het dagelijks aanvullen van het medium totdat de cellen 80% samenvloeiing bereiken, wat ongeveer vier tot vijf dagen duurt. Wanneer de kolonies 80% samenvloeiing bereiken, voeg dan een mengsel van collagenase en dispase toe om ze enzymatisch los te maken van het gerecht. Zodra de kolonies beginnen op te tillen, verwijdert u de schaal uit de broedmachine en voegt u twee milliliter DPBS toe om de enzymactiviteit te neutraliseren. Schraap met DPBS de kolonies af en verzamel de suspensie in een conische buis van 15 milliliter, met behulp van een serologische pipet van 10 milliliter met brede plank. Tricureer vervolgens met een serologische pipet van 10 milliliter de suspensie voorzichtig twee tot drie keer om de kolonies op te breken. Laat de kolonies zich vestigen. Zuig na ongeveer twee minuten het DPBS-enzymmengsel op terwijl er ongeveer een milliliter vloeistof in de buis overblijft. Voeg vervolgens twee milliliter DPBS toe aan de buis en meng door zachtjes te tikken om de kolonies opnieuw te suspenderen. Laat ze bezinken en herhaal dit proces twee keer om het resterende enzym te verwijderen. Na het verwijderen van de supernatant, suspendeert u de kolonies opnieuw in een milliliter van complete essential eight medium en plaatst u ze op een vers bereide schaal met Matrigel-coating. Enzymatisch liften de door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen zoals eerder beschreven. Plaats ze op een niet-klevende suspensiecultuurschaal van 100 millimeter met chemisch gedefinieerd medium. Plaats de celsuspensie op een orbitale schudder met 40 omwentelingen per minuut gedurende zeven dagen onder normoxische omstandigheden om de ontwikkeling van corticobollen te vergemakkelijken. Breng op dag acht de corticobolletjes over naar een celproliferatiemedium en houd ze zeven dagen vast. Om gliaspecificatie te induceren, incubeert u de corticobolletjes gedurende twee weken in gliaverrijkingsmedium om vroege gliasferen te verkrijgen. Voor rijping van vroege gliabolletjes, vervang basale fibroblastgroeifactor H door 20 nanogram per milliliter leukemieremmende factor en houd de bollen gedurende vier weken in stand.

Na vier weken in het rijpingsmedium de bollen gedurende langere tijd in het gliaalverrijkingsmedium blijven houden. Om aggregatie en verlies van levensvatbaarheid te voorkomen, hakt u de gliabolletjes elke twee weken mechanisch met behulp van een steriel industrieel mes. Vervang het hele medium door DNase one om DNA-fragmenten te verwijderen die zijn gegenereerd door hakken. Dissocieer vervolgens de gliasferen in monolagen van astrocyt-voorlopercellen, met behulp van een papaïnedissociatiekit. Plaats de gedissocieerde cellen op een celcultuur, behandeld aanhangend schaaltje dat is voorgecoat met Matrigel in een verdunning van één tot 80. Propageer de voorlopercellen van astrocyten in gliaverrijkingsmedium totdat ze 80% samenvloeiing bereiken. De doorgang van de cellen verwijdert het verbruikte medium en verzamelt het in een conische buis. Voeg enzymcelloslatingsmedium toe aan de cellen en wacht één tot twee minuten. Zodra de cellen beginnen los te laten, voegt u het gebruikte medium toe om de enzymactiviteit te neutraliseren. Vang de celsuspensie op en centrifugeer gedurende twee minuten bij 800 G. Nadat u de supernatant hebt weggegooid, suspendeert u de cellen opnieuw in het gliaverrijkingsmedium. Plaat ongeveer één keer 10 tot de macht van zes cellen per putje op een met Matrigel beklede schaal in een verdunning van één tot 80. Voor cryo-conservering suspendeert u de celpellet opnieuw in een koud mengsel van 90% corticobolproliferatiemedium en 10% cryoprotectant. Breng de geresuspendeerde cellen over in cryoflesjes. Verplaats de cryoflesjes onmiddellijk in een cryodoos en bewaar ze een nacht in een vriezer bij min 80 graden Celsius. Breng de volgende dag alle cryoflesjes over naar een tank met vloeibare stikstof voor langdurige opslag. Karakteriseer de gedissocieerde astrocyt-voorlopercellen door immunokleuring met Vimenton- en nucleaire factor IAM-markers. Om de vier hersenregionale specificiteit van menselijke IPSC-afgeleide APC's te bevestigen, voert u een real-time QPCR-analyse uit voor de menselijke vorkkopbox G1 en de menselijke homeobox, B4. Differentieer APC's in astrocyten en astrocytisch differentiatiemedium gedurende 14 dagen. Plaat astrocyten op een schotel met glazen bodem van 35 millimeter met een dichtheid van vijf keer 10 tot de macht van drie cellen per schotel om hun respons op adenosine vijf trifosfaat te meten. Laat de cellen 24 uur aan de glazen bodem hechten. Was de aangehechte cellen drie keer met Hank's Balanced Salt Solution zonder calcium. Incubeer vervolgens de cellen in het kweekmedium met metrische diureide met een micromolaire verhouding van vijf 2:00 uur en 0,02% pluronzuur F127 gedurende een uur bij kamertemperatuur. Nadat u de cellen twee keer hebt gewassen met kweekmedium, vervangt u het medium door calcium van twee millimolair met Hank's Balanced Salt-oplossing. Beeld de cellen af met twee frames per seconde, met behulp van een 60X olie-immersie-objectief op een omgekeerde microscoop die gefocusseerde drift compenseert. Noteer ten slotte ATP-geïnduceerde calciumresponsen na toevoeging van ATP in een eindconcentratie van vijf millimolair na 25 seconden. Menselijke IPSC-kolonies brachten pluripotente markers tot expressie en kiezen vier en nano, zoals bevestigd door immunokleuring. APC's afgeleid van het fragiele X-syndroom en controlelijnen vertoonden vergelijkbare proporties vimentine- en NFIA-positieve cellen. Astrocyt-voorlopercellen van zowel controle- als fragiele X-syndroom door mensen geïnduceerde pluripotente stamcellen vertoonden opregulatie van Fox G1, vergeleken met HOXB4, wat wijst op een identiteit van de voorhersenen. Astrocyten afgeleid van menselijke IPSC fragiele X-syndroomlijnen vertoonden een verminderd aantal GFAP-expressie. Controle- en fragiele X-syndroomastrocyten vertoonden ATP-geïnduceerde calciumtransiënten, maar het aantal responders was significant lager bij astrocyten van het fragiele X-syndroom. De piekamplitude van de eerste ATP-opgewekte calciumtransiënt was significant lager in astrocyten van het fragiele X-syndroom in vergelijking met de controlecellen. Humane IPSC-afgeleide fragiele X-syndroomastrocyten vertoonden een toename van glycolyse, glycolytische capaciteit en glycolytische reserves, maar vertoonden een significante afname van maximale ademhaling in vergelijking met controleastrocyten.