CRISPR-epigenoombewerking in menselijke cellen met behulp van plasmide-DNA-transfectie en mRNA-nucleofectieafgifte
30 mei 2025
Het protocol beschrijft methoden voor geclusterde, regelmatig tussenliggende korte palindromale herhalingen (CRISPR)-gebaseerde epigenoombewerking in menselijke cellijnen met behulp van plasmide-DNA-transfectie en mRNA-nucleofectie.
Dit onderzoek heeft tot doel epigenomische editors te ontwerpen en af te leveren in menselijke cellen. We doen dit door chromatine-effectoren te fuseren met dCas9 voor gerichte genmodulatie zonder toxische DNA-breuken te introduceren. Uitdagingen draaien om het efficiënt afleveren van epigenoomeditors in cellen en het waarborgen van nauwkeurige doelspecificiteit.
Bovendien blijft het moeilijk om stabiele of voorbijgaande genonderdrukking te bereiken. Dit protocol vermijdt splijtingsmechanismen, waardoor toxiciteit en genomische instabiliteit worden verminderd. Het beschrijft twee toedieningsmethoden voor gecontroleerde genexpressiemodulatie zonder permanente DNA-sequentiewijzigingen.
Deze methoden kunnen worden toegepast om verschillende fusies met dCas9 te testen en om de basisbiologie van chromatine te bestuderen. De huidige epigenoomeditors kunnen worden gebruikt voor genoombrede schermen en hebben het potentieel voor therapeutische toepassingen. Bewaar om te beginnen K-562-cellen in een kolf met RPMI-media aangevuld met 10% FBS en penicilline-streptomycineglutamine.
Ontdooi op de dag van de nucleofectie CRISPRoff mRNA in een steriele RNA-vrije microcentrifugebuis en draai de buis voorzichtig vortex. Gebruik twee microgram mRNA per 2,0 keer 10 tot de macht van vijf cellen in elk putje van een PCR-stripbuisje dat op ijs is geplaatst. Bereid de nucleofectieoplossing volgens de instructies van de fabrikant en laat deze 15 minuten opwarmen tot kamertemperatuur voordat u nucleofectie uitvoert.
Oogst en tel K-562-cellen met behulp van een geautomatiseerde cellenteller met trypanblauwe levend/dode kleuring. Voor nucleofectie in een stripcuvet wordt ongeveer twee maal 10 tot de macht vijf cellen per monster in een steriele microcentrifugebuis gedoseerd. Centrifugeer de cellen bij 500 G gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur.
Gooi het bovenstaande weg. Voeg PBS op kamertemperatuur toe aan de celpellet en centrifugeer opnieuw gedurende vijf minuten bij 500 G. Gooi het bovenstaande weg.
Resuspendeer de cellen in de juiste hoeveelheid nucleofectoroplossing. Voeg het berekende volume celoplossing toe aan twee microgram CRISPRoff-oplossing. Breng de cel- en mRNA-oplossing over naar een cuvet en zorg ervoor dat er geen belletjes ontstaan, omdat dit de nucleofectie-efficiëntie in gevaar kan brengen.
Tik zachtjes op de Nucleocuvette om de cellen aan de onderkant te laten bezinken. Nucleofecteer vervolgens de cellen met behulp van het 4D-Nucleofector-systeem met de juiste pulscode. De pulscode moet mogelijk worden geoptimaliseerd voor verschillende celtypen.
Overleg met de fabrikant of er aanvullende optimalisatie nodig is. Voeg na nucleofectie 80 microliter RPMI-media toe aan elke gebruikte put van de Nucleocuvette. Breng de celsuspensie over in een putje van een plaat met 24 putjes met 400 microliter voorverwarmde RPMI-media.
Laad alle flowcytometriestandaard- of FSC-bestanden in FlowJo door ze naar een nieuw werkblad te slepen en neer te zetten. Klik op alle voorbeelden om te beginnen met het maken van poorten. Open een controlevoorbeeld door te dubbelklikken op het bijbehorende bestand.
Maak een poort voor levende cellen in een FSC-A versus SSC-A-plot met behulp van de polygoontool. Er zou nu een tabblad met actieve cellen moeten verschijnen onder de naam van het voorbeeld in de lijst met alle voorbeelden. Klik met de rechtermuisknop op deze poort en selecteer Kopieer analyse om te groeperen om deze poort op alle monsters toe te passen.
Dubbelklik op de poort van de live cellen om alleen live cellen te selecteren. Verander de assen in FSC-H versus FSC-A. Teken een veelhoek om alleen voor afzonderlijke cellen te poorten.
Dubbelklik op de poort voor het uitdrukken van cellen met gids om alleen enkele cellen te selecteren. Verander de assen in FSC-A versus PE-CF594-A. Teken een poort voor het uitdrukken van cellen met behulp van de veelhoek.
Dubbelklik op de laatste instellingspoort, ofwel enkele cellen of gidsuitdrukkingscellen. Als het uitvoeren van een plasmidetransfectie waar de epigenoomredacteur codeert voor een blauw fluorescerend eiwit, of BFP-fusie, creëer dan een poort voor BFP-positieve cellen voor dag twee monsters. Maak een poort voor reporterexpressie door BB515-A uit te zetten tegen FSC-A om GFP-negatieve cellen te identificeren en te poorten.
Pas deze poort vervolgens toe op alle monsters. Nadat u de poortconfiguratie hebt voltooid, klikt u op tabeleditor in het bovenste paneel. Sleep populaties mee voor analyse, zoals BFP-positieve en GFP-negatieve cellen.
Klik in het deelvenster voor de tabeleditor op tabel maken en kopieer de gegevens voordat u deze in een spreadsheet plakt voor normalisatieberekeningen. Trek nu het aantal reporter-negatieve cellen, zoals GFP-negatief, in de controlesteekproef af van alle andere steekproeven. Dit corrigeert het tot zwijgen brengen van de verslaggever op de achtergrond.
Als het uitvoeren van een transfectie, deel elke waarde door het percentage BFP positieve cellen dat op dag twee wordt gemeten om alle waarden aan het percentage BFP positieve cellen te normaliseren, dan vermenigvuldig met 100. Dit levert de genormaliseerde waarde van de transfectieefficiency van de bewerkte cellen op. Teken de gegevens om lijngrafieken te maken die veranderingen weergeven in het verloop van de bewerkingstijd van het epigenoom.
Voor alle experimenten met epigenoombewerking wordt een niet-targetinggidscontrole aanbevolen om te bevestigen dat veranderingen op de doelloci het gevolg zijn van epigenoombewerking in plaats van overexpressie of niet-specifieke binding van de epigenoomeditor. Het is belangrijk om rekening te houden met de toedieningsmethode van de epigenoomeditor. Plasmide-DNA-transfectie of mRNA-nucleofectie kan de voorkeur hebben gezien de experimentele context.
Overweging van het celtype, de experimentele tijdlijn, de uitlezing van de toediening en de doeltreffendheid van de toediening kunnen van invloed zijn op de voorkeurstoedieningsmethode. Cellen die twee dagen na transfectie hoge niveaus van BFP tot expressie brengen, duiden op succesvolle transfectie met de epigenoomeditor. Zowel CRISPRoff als CRISPRi vertonen piekuitschakeling van het gen op dag vijf na transfectie.
In mRNA-nucleofectie-experimenten wordt sterke genuitschakeling waargenomen op dag drie na de nucleofectie met CRISPRoff.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft methoden voor het afleveren van epigenomische editors in menselijke cellen met behulp van CRISPR-gebaseerde technieken. Door chromatin effectoren te fuseren met dCas9 kan gerichte genmodulatie worden bereikt zonder toxische DNA-breuken te veroorzaken.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Genetica
- Celbiologie
Achtergrond
- De efficiënte aflevering van epigenoom-editors in cellen vormt een aanzienlijke uitdaging.
- Het handhaven van een precieze doelspecificiteit is cruciaal voor een succesvolle genmodulatie.
- Stabiele of transiënte genrepressie kan moeilijk te bereiken zijn.
- Dit protocol vermijdt klievingsmechanismen om toxiciteit en genomische instabiliteit te verminderen.
Doel van de studie
- Om epigenomische editors te ontwerpen en af te leveren in menselijke cellen.
- Om gerichte genmodulatie mogelijk te maken zonder toxische DNA-breuken.
- Om methoden te bieden voor gecontroleerde modulatie van genexpressie.
Gebruikte methoden
- Transfectie van plasmid DNA
- Nucleofectie van mRNA
- Fusie van chromatine-effectoren aan dCas9
- Vermijden van splitsingsmechanismen
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle aflevering van epigenoom-editors in menselijke cellen.
- Gerichte genmodulatie bereikt zonder het introduceren van DNA-breuken.
- Waargenomen afname in toxiciteit en genomische instabiliteit.
- Methoden maken gecontroleerde modulatie van genexpressie mogelijk.
Conclusies
- Dit protocol biedt effectieve methoden voor epigenoomredigering.
- Het pakt belangrijke uitdagingen aan in genmodulatietechnieken.
- Toekomstige toepassingen kunnen gentherapiebenaderingen verbeteren.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de industrie
Epigenoommodificatie op basis van CRISPR maakt programmeerbare, locus-specifieke genregulatie in menselijke cellen mogelijk zonder DNA-breuken te veroorzaken, waardoor genomische instabiliteit en toxiciteit worden verminderd. Deze benadering ondersteunt vroege ontdekking en targetvalidatie door nauwkeurige, omkeerbare modulatie van genexpressie mogelijk te maken, wat mechanistische risicoreductie en functionele analyse van ziekte-relevante signaalpaden vergemakkelijkt. De compatibiliteit van het protocol met zowel plasmid-DNA-transfectie als mRNA-nucleofectie vergroot de bruikbaarheid over diverse cellsystemen en experimentele tijdlijnen.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt functionele ondervraging van genregulerende mechanismen mogelijk zonder permanente genoomwijziging.
- Ondersteunt mechanistische risicoreductie door directe epigenetische effecten te onderscheiden van off-target toxiciteit.
- Faciliteert snelle, reversibele genrepressie of -activatie voor verduidelijking van signaalroutes.
- Biedt een platform voor het testen van meerdere dCas9-effectorfusies in ziekterelevante systemen.
Screening & Assayontwikkeling
- Bereidt gevalideerde celmodellen voor voor downstream compound-screening door genexpressie epigenetisch te moduleren.
- Maakt kwantitatieve beoordeling van de editing-efficiëntie mogelijk met behulp van flowcytometrie en reporternormalisatie.
- Ondersteunt reproduceerbare, schaalbare workflows voor high-throughput screening van epigenoom-editors.
- Maakt normalisatie en achtergrondcorrectie mogelijk om betrouwbare assay-resultaten te garanderen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Maakt modellering mogelijk van stabiele of transiënte gensilencing die relevant is voor ziekteprogressie en therapeutische interventie.
- Sluit aan bij translationele biomarkerstrategieën door duurzame genrepressie (CRISPRoff) of transiënte modulatie (CRISPRi) mogelijk te maken.
- Ondersteunt de continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie door permanente genomische veranderingen te vermijden.
- Vermindert het risico op verstorende genomische instabiliteit in preklinische modellen.
Integratie van Pipeline & Workflow
Dit protocol is geïntegreerd in het continuüm van ontdekking naar preklinisch onderzoek door hypothese-gestuurde genmodulatie, assay-ontwikkeling en translationele modellering mogelijk te maken zonder permanente genoommodificatie.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt het testen van nulhypothesen en padanalyse door middel van gerichte, omkeerbare genregulatie.
- Screening: Biedt kwantitatieve, reproduceerbare read-outs voor assay-standaardisatie en evaluatie van verbindingen.
- Analytiek: Levert genormaliseerde, achtergrondgecorrigeerde metingen voor het vergelijken van bewerkingscondities en afleveringsmethoden.
- Translationeel onderzoek: Maakt modellering mogelijk van epigenetische regulatie die relevant is voor ziekten en therapeutische respons.
- Bedrijfbrede hergebruikbaarheid: Biedt een modulair, aanpasbaar platform voor diverse gentargets en celtypen binnen R&D-programma's.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen bij targetvalidatie en vermindert mechanische ambiguïteit.
- Operationele waarde: Verbetert de standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van workflows voor genmodulatie.
- Strategische waarde: Verbetert de go/no-go besluitvorming en kapitaalefficiëntie door biologische risico's in een laat stadium te minimaliseren.
- Portfolio-impact: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering en voortgang van gentargets mogelijk op basis van functioneel bewijs.
Overwegingen voor Implementatie
- Vereist expertise in CRISPR-ontwerp, celkweek en flowcytometrie-analyse.
- Toegang tot nucleofectie-instrumentatie en analytische software voor kwantitatieve resultaten is noodzakelijk.
- Standaardisatie van gating-strategieën en normalisatieprocedures tussen teams is vereist.
- Moet worden aangepast aan het celtype, de afleveringsmethode en de experimentele tijdlijn op basis van de projectbehoeften.
- Overweging van de efficiëntie van de aflevering en reportercontroles is cruciaal voor een betrouwbare interpretatie.
