En gezicht Cryosectie van het netvlies van de muis voor hoogdimensionale ruimtelijke moleculaire analyse

Het netvlies is een nuttig model voor het begrijpen van neuronale berekeningen. Deze berekeningen zijn afhankelijk van de speciale posities van cellen. Uitgebreide kaarten hiervan zijn echter ongrijpbaar gebleven.

In het afgelopen decennium heeft sequencing van afzonderlijke cellen duidelijke beschrijvingen opgeleverd van retinale celtypen. Nu biedt ruimtelijke transcriptomics een nieuwe manier om deze beschrijvingen in intact weefsel te gebruiken. Een cruciale uitdaging voor het gebruik van ruimtelijke transcriptomics is dat ze zeer dunne weefselsecties vereisen. Het netvlies is al vrij dun in het horizontale vlak waarin we geïnteresseerd zijn.

Door deze methode uit te vinden om dunne en snelle secties te maken, om ruimtelijke transcriptomics in machine learning te gebruiken om alle retinale ganglioncellen in hetzelfde weefsel in kaart te brengen. In de afgelopen 30 jaar zijn slechts 17 van de 45 retinale ganglioncellen van muizen in kaart gebracht, en deze techniek stelde ons in staat om ze allemaal tegelijk in kaart te brengen.

[Docent] Plaats om te beginnen een geëuthanaseerde muis op de werktafel. Liep de tijdelijke pool van de wereldbol op het hoornvlies om de oriëntatie te behouden en een zwak punt voor dissectie te creëren. Dompel de wereldbol onder en richt de oplossing in een schaal met een stuk filtreerpapier. Met een scherpe tang nummer vijf en een irisschaar verwijder je voorzichtig alle spieren, fascia, vaatstelsel en zenuwen van de wereldbol zonder de sclera te doorboren. Plaats de punt van een Iris-schaarblad loodrecht op het hoornvliesmerk. Doorboor de wereldbol op deze positie. Maak een enkele schone incisie door het hoornvlies en de limbus en ga verder in de sclera en het netvlies in de richting van de oogzenuwkop. Plaats het mes vervolgens loodrecht op de eerste snede, ongeveer een millimeter achter de limbus. Begin radiaal door de sclera en het netvlies te snijden. Zorg voor een consistente snijlijn posterieur en evenwijdig aan de limbus door een scherpe tang te gebruiken om de wereldbol te geleiden en te draaien. Als het netvlies en de sclera uit elkaar gaan, verplaats dan het schaarblad van de iris om ze samen te knippen. Schat de achterste afstand van één millimeter met behulp van de middelste breedte van het irisschaarblad Na het voltooien van de radiale snede evenwijdig aan de limbus, inspecteert u op resterende netvliesverbindingen. Knip deze voorzichtig door met een Iris-schaar totdat de voorste en achterste bol gescheiden zijn. Gebruik vervolgens twee paar scherpe tangen nummer vijf om het voorste en achterste deel van de wereldbol voorzichtig te scheiden. Bij oudere muizen, als transparante vezels de lens verbinden met de retinale cup, snijd deze dan voorzichtig door met een irisschaar terwijl de scheiding van de retinale sclerale buis tot een minimum wordt beperkt. Gebruik het filterpapier als steunplatform om het netvlies in een klaverblad te knippen, ook wel een ijzeren kruispatroon met een irisschaar genoemd. Herhaal de dissectie met het tweede oog. Knip de punt van een plastic transferpipet af om een opening te maken die groter is dan het ontlede netvlies en de sclera. Zuig het netvlies voorzichtig in de pipet en leg het op een glazen microscoopglaasje. Verwijder met een laboratoriumdoekje overtollige richtoplossing totdat het netvlies niet meer drijft en kan worden afgeplat. Gebruik nu twee scherpe tangen nummer vijf om het netvlies uit te vouwen en plat te plaatsen met de binnenste oogschelp naar boven gericht. Maak reliëfsneden van 0,5 tot twee millimeter lang in elk klaverreliëfsegment om het afvlakken te vergemakkelijken en pas aan om vouwen te voorkomen. Verwijder alle resterende richtoplossing, behalve de vloeistof die zich aan het netvlies bevindt. Gebruik een dekglaasje om snel op het netvlies te drukken en over te brengen zodat de buitenste sclera naar boven wijst en de binnenste oogschelp in contact is met het dekglaasje. Controleer of het netvlies niet gevouwen is en pas indien nodig aan. Voeg richtoplossing toe om manipulatie te vergemakkelijken, maar verwijder het overtollige met een doekje om krullen te voorkomen en laat vijf tot 10 seconden aan de lucht drogen. Breng nu OCT-medium aan om het netvlies te bedekken. Gebruik vervolgens een tang om de laag gelijkmatig over de dekstrook te verdelen om drijfvermogen te voorkomen. Bevries het netvlies in OCT-medium met behulp van een metalen plaat gekoeld met vloeibare stikstofdamp of door rechtstreeks in contact te komen met droogijs. Bewaar de bevroren netvlies op droogijs voor direct gebruik. Maak voor cryosectie een OCT-koepel op de klauwplaat, die de binnenste twee tot drie annuli beslaat als hetzelfde cryostaatmodel wordt gebruikt. Lijn de klauwplaat plat uit met het snijoppervlak. Maak of noteer de oriëntatiegids die de klauwplaat relateert aan de cryostaatfase. Snijd vervolgens de koepel bij om een plat oppervlak te vormen dat evenwijdig aan het mes loopt. Verwijder met een scheermesje overtollig OCT zijdelings en scheid voorzichtig het netvlies van het dekglaasje om het mobiel te maken. Verwijder de boorkop van het podium en breng een kleine druppel vloeibare OCT aan op het voorbereide vlakke OCT-oppervlak. Plaats vervolgens het netvlies rechtstreeks op de vloeibare OCT. Gebruik een voorgekoeld glasplaatje om het netvlies ingedrukt te houden totdat het bevroren is. Breng meer OCT aan op het netvlies en de chuck om hechting te garanderen. Vries het geheel vervolgens in het snelvriesgebied van de cryostaat in. Knip voor het snijden voorzichtig overtollige OCT bij totdat het netvlies zichtbaar is. Gebruik een scheermesje om de OCT-blokranden dicht bij het netvlies te vormen. Ga door met trimmen terwijl u inspecteert op aanwezigheid van sclera. Wanneer de sclera zichtbaar is, past u de hoek van de tafel indien nodig aan. Stop met trimmen wanneer de sclera ongeveer gelijkmatig over de secties is verdeeld. Gebruik nu voorgekoelde dia's en twee penselen om de secties te manipuleren en te verzamelen. Plaats een vinger ongeveer vijf seconden onder het gedeelte totdat de OCT smelt en het weefsel aan het objectglaasje hecht. Plaats de dia vervolgens terug op een koud oppervlak om opnieuw in te vriezen. Bewaar de voorbereide dia's op droogijs voor onmiddellijk gebruik. Duidelijke immunoreactiviteit of RBPMS in de ganglioncellaag en duidelijke scheiding van vasculaire plexi gelabeld door tomatenlectine bevestigden succesvol behoud van retinale laminatie en eiwitmarkers. Multiplex-RNA-detectie met behulp van een 12-plex RNA Scope-paneel behield met succes de ruimtelijke structuur en onthulde een duidelijke expressie van markers zoals Grm6 en RBPMS over de plak op het gezicht. Beelden met hoge resolutie bevestigden expressiepatronen van één cel voor RBPMS en andere markers zoals Mafb6 en Meis2, waarbij zowel eiwit- als RNA-lokalisatie in de ganglioncellaag werd gevalideerd. Uniforme signaalverdeling over klaverbladsecties en sterke signalen in xenium ruimtelijke transcriptomische gegevens bevestigden succesvolle high-throughput profilering en RNA-integriteit. Visualisatie van de resolutie van één cel met behulp van xenium gematchte handmatige detectiepatronen die de robuustheid van het protocol op verschillende platforms bevestigen. Celtypespecifieke transcriptmarkers vertoonden gestratificeerde laminaire verdeling in retinale dwarsdoorsnede en bij het in kaart brengen van het gezicht, en behielden hun locatie over diepten. Gedetailleerd inzoomen op de ganglioncellaag bevestigde nauwkeurige detectie van ruimtelijke transcripten ten opzichte van DAPI-nucleaire kleuring.