Beeldvorming van C. elegans met hoge resolutie in alle larvale stadia

In het lab werken we aan allerlei ontwikkelingsbiologische vragen. Zelf werk ik meer aan de technische kant en ontwikkel ik methoden om deze vragen beter aan te pakken met behulp van beeldvormingstechnieken. Het C. elegans-veld heeft met succes een grote verscheidenheid aan methoden toegepast, variërend van CRISPR-genbewerking, transcriptomics en proteomics tot superresolutiemicroscopie. C. elegans is een verbazingwekkend model, maar in de context van in vivo observatie met hoge resolutie brengt het zijn uitdagingen met zich mee, die immobilisatie vereisen voor de beste resolutie, wat op zijn beurt de levensvatbaarheid van dieren beperkt. Het protocol biedt een mogelijke oplossing voor langdurige beeldvorming van C. elegans, waardoor onderzoekers de methode in hun eigen laboratorium kunnen toepassen en een breed scala aan dynamische ontwikkelingsprocessen direct in vivo kunnen bestuderen. Binnen het lab heeft de methode gedetailleerde observatie van orgaanvorming mogelijk gemaakt, bijvoorbeeld in de context van morfogenese of na somatische celdelingen tot in de volwassenheid. De methode is sindsdien overgenomen door tal van laboratoria die een breed scala aan ontwikkelingsprocessen bestuderen.

[Presentator] Bevestig om te beginnen het apparaat aan het steunframe en monteer het op de rechtopstaande microscoop. Vul een spuit met gedeïoniseerd water en bevestig vervolgens een naald van 23 gauge en een lang stuk van een bij 16-inch slang met een holle gebogen stalen pen. Vul de slang met gedeïoniseerd water uit de spuit en steek de stalen pen in het geperforeerde gat van de klepinlaat om de slang aan te sluiten. Verwijder de spuit en de naald voordat u de slang op de off-chip solenoïde bevestigt. Gebruik de beeldvormingssoftware om de solenoïde in te schakelen en het apparaat enkele minuten onder druk te zetten om alle lucht uit de klep te verdrijven. Controleer de voltooiing door visueel te controleren of de lucht-waterinterface donker lijkt en in het PDMS-materiaal verdwijnt. Schakel de solenoïde uit met behulp van de beeldvormingssoftware. Vul vervolgens een spuit van een milliliter met de gefilterde bacterieoplossing en bevestig een naald van 30 gauge en een lang stuk slang van één bij 32 inch aan de naald. Druk op de zuiger om zowel de naald als de aangesloten slang te vullen met de bacterieoplossing. Steek vervolgens met een pincet de ene bij 32-inch slang rechtstreeks in de voedselinlaat van het microfluïdische apparaat en plaats de spuit op de spuitpomp. Druk met de duimschroef aan de achterkant op de zuiger van de spuit om het apparaat met vloeistof te vullen. Blokkeer zowel de worminlaat als de uitlaat met afgedichte stalen pennen en oefen extra druk uit met de stelschroef om eventuele resterende lucht uit het apparaat te verwijderen. Verwijder vervolgens de geblokkeerde stalen pin bij het stopcontact en bevestig de afvalcontainer aan het stopcontact. Druk op de spuit om er zeker van te zijn dat de afvalcontainer goed is aangesloten en dat er geen verstoppingen in het systeem zijn. Verwijder de tweede geblokkeerde stalen pen uit de inlaat en duw op de spuit totdat er een kleine druppel vloeistof bij de worminlaat verschijnt. Bevestig vervolgens met behulp van een naald van 23 gauge een langer stuk van een bij 16-inch slang van ongeveer 15 tot 20 centimeter aan een spuit van één milliliter gevuld met S-basale buffer. Bevestig een rechte 23-gauge stalen pin aan het andere uiteinde van de buis. Vul de naald en het slangetje met S-basale buffer uit de spuit. Steek nu de stalen pin aan het uiteinde van de slang in de buis met de wormen en duw een kleine hoeveelheid vloeistof door de slang om ervoor te zorgen dat er geen lucht achterblijft. Trek de wormen in de slang zonder ze in de spuit te trekken. Duw vervolgens op de spuit die op de wormen is aangesloten totdat er een kleine druppel vloeistof op de stalen pen verschijnt en steek de stalen pen in de worminlaat van het microfluïdische apparaat. Plaats het apparaat op een microscoop met een lage vergroting, 5x of 10x, of op een dissectiemicroscoop. Plaats het apparaat zo dat de inlaat aan de ene kant van het gezichtsveld zichtbaar is en de achterkant van de inlaat van het vangkanaal aan de andere kant. Duw voorzichtig op de zuiger van de wormspuit. Duw vervolgens de dieren in de richting van de kanaalarray. Zodra een dier naar het kanaal kijkt, duw je het in het kanaal en herhaal je dit voor extra dieren. Nadat u voldoende dieren hebt gevangen, plaatst u de spuit, die nog steeds aan de worminlaat is bevestigd, op de microscooptafel waar deze gedurende het hele experiment zal blijven. Als het laden op een dissectiemicroscoop is uitgevoerd, brengt u het apparaat over naar de beeldmicroscoop. Schakel nu de spuitpomp in en laat deze draaien met een vooraf ingestelde snelheid van één microliter per uur voor 0.5 microliter. Programmeer de spuitpomp zo dat deze draait met één microliter per uur voor 0,5 microliter, waarna het debiet wordt verhoogd met 100 microliter per uur voor 0,5 microliter en het stroompatroon gedurende het hele experiment wordt herhaald. Plaats het apparaat op de microscooptafel en zorg ervoor dat het stevig wordt vastgehouden. Schakel over naar de gewenste beeldvergroting. Identificeer de dieren en interessegebieden binnen de cascadekanaalarray en stel de gewenste beeldvormingscondities in. Beeld onder de gewenste beeldvormingsomstandigheden, waarbij de on-chip-klep 10 seconden voor de beeldacquisitie door de solenoïde wordt bediend, zodat de dieren op hun plaats worden gehouden. Het microfluïdische apparaat behield een hoge beeldkwaliteit in verschillende microscopiemodaliteiten, waaronder helderveld, epifluorescentie, confocale draaiende schijf en superresolutiemethoden dankzij het gebruik van een 170 micrometer dik dekglas. Ontwikkeling van Caenorhabditis elegans-epitheelcellen gevisualiseerd van het vroege L1-stadium tot het midden van het L2-larvale stadium. Inductie van de primaire vervaagde vulva-voorlopercellen en hun daaropvolgende delingen van late L1 tot het vroege L4-larvale stadium was duidelijk. Stadia van vulvavorming van vroeg L3 tot volwassenheid. Verkregen beelden werden verbeterd door beelddeconvolutie en -registratie, waardoor de visuele helderheid werd verbeterd Waargenomen celdelingen vonden op een consistente en tijdige manier plaats bij alle dieren, waarbij alle delingen werden voltooid binnen de typische duur van het larvale stadium. De lengte van de geslachtsklieren nam gestaag toe tijdens de L2- en L3-stadia, waarbij consistente metingen mogelijk werden gemaakt door de rechte oriëntatie van de dieren.