Verbeterde genafgifte en -expressie met behulp van intraossale injectie van chitosan-nanodeeltjes ingekapselde adeninebase-editorplasmiden

We stellen een gentherapiemethode voor die op adenine gebaseerde Editor Chitosan rechtstreeks in het beenmerg toedient via intraossale injectie. De transfectie-efficiëntie van exogene plasmiden in proefdieren is relatief laag en de introductie van plasmiden voor genexpressie op lange termijn kan worden beïnvloed door het immuunsysteem. We gebruiken de to-chitosan om op adenine gebaseerde editorplasmiden in te kapselen en het complex rechtstreeks in het beenmerg van muizen af te leveren via intraossale injectie, waardoor het geschikt is voor ziekten veroorzaakt door een abnormale osteoclastfunctie.

Ons protocol biedt een hoge transfectie-efficiëntie, kleine biologische schade en een hoge genexpressie-efficiëntie. Onze nieuwe strategie is niet alleen geschikt voor ziekten die worden veroorzaakt door een abnormale osteoclastfunctie, maar heeft ook een aanzienlijk potentieel voor het bevorderen van het gebied van gentherapie. Plaats om te beginnen een geëuthanaseerde muis op een werktafel.

Verwijder met een chirurgische schaar en pincet het scheenbeen en verwijder al het omringende spierweefsel. Week het gereinigde scheenbeen in PBS en was tot alleen het bot overblijft. Zuig een milliliter PBS in een spuit en spoel de beenmergcellen vanaf het ene uiteinde van het scheenbeen totdat het bot helemaal wit wordt.

Verzamel vervolgens de celsuspensie in een buisje. Centrifugeer het gedurende vijf minuten bij 800 G bij vier graden Celsius. Voeg na het pipetteren van het supernatant 500 microliter lysisbuffer van rode bloedcellen toe aan de pellet.

Voeg na een minuut een milliliter scheidingsbuffer toe om de lysis te beëindigen. Centrifugeer de suspensie opnieuw bij 800 G bij vier graden Celsius gedurende vijf minuten. Verwijder het bovenstaande en plaats de resulterende celpellet op ijs voor later gebruik.

Voor chitosantransfectie lost u vier milligram chitosan op in 20 milliliters azijnzuuroplossing. Stel de pH in op 5,5 met behulp van 10 molair natriumhydroxide. Doseer vervolgens 500 microliter van de chitosan-oplossing in individuele microcentrifugebuisjes.

Voeg nu twee, drie, vier en vijf microgram ABE-plasmiden toe aan afzonderlijke buisjes. Los de plasmiden op in 500 microliter 30 millimolair natriumsulfaat. Meng vervolgens 500 microliter plasmideoplossing met 500 microliter chitosanoplossing in de bijbehorende buisjes.

Incubeer de buisjes in een waterbad bij 50 tot 55 graden Celsius gedurende 15 minuten. Vortex elke buis gedurende 15 tot 30 seconden en laat ze 30 minuten ongestoord staan. Analyseer voor karakterisering de diameter en zetapotentiaal van chitosan met behulp van dynamische lichtverstrooiing.

Houd de concentratie chitosan op 0,1 milligram per milliliter in dubbel gedestilleerd water. Giet vervolgens 0,1 milligram per milliliter chitosanmonsters op een siliciumchip. Voeg 20 microliter van de geresuspendeerde monsters toe aan 200 gaasroosters en incubeer.

Centrifugeer de beenmergcelsuspensie bij 800 G bij vier graden Celsius gedurende vijf minuten. Gooi het supernatant weg en voeg vervolgens 500 microliter lysaat van rode bloedcellen toe. Voeg na een minuut een milliliter scheidingsbuffer toe om de reactie te stoppen.

Tel vervolgens het aantal cellen met een cellenteller. Breng vervolgens 1 miljoen cellen over in een nieuwe microcentrifugebuis. Na opnieuw centrifugeren, pipetteer het bovenstaande eruit en suspendeer de cellen in 500 microliter PBS.

Breng de geresuspendeerde cellen over in een flowcytometriebuis en meet de transfectie-efficiëntie met behulp van flowcytometrie. Voor injectie in de beenmergholte fixeert u de verdoofde muis in rugligging op de operatietafel. Gebruik plakband om de voorste tak op zijn plaats te houden.

Desinfecteer het achterste scheenbeen met een alcoholdoekje. Laad vervolgens de plasmide-oplossing in een spuit van één milliliter die is uitgerust met een naald van 26 gauge. Verwijder eventuele luchtbellen en houd de spuit gereed voor injectie.

Raak vervolgens het scheenbeen van de muis aan en stabiliseer het met uw vingers. Plaats de injectienaald om de scheenbeenschacht binnen te gaan vanaf het scheenbeenplateau bij het kniegewricht. Draai nu de naald evenwijdig aan het scheenbeen, breng deze in de beenmergholte in en injecteer langzaam gedurende drie seconden.

Trek de naald na de injectie langzaam terug gedurende drie seconden. Desinfecteer de prikplaats onmiddellijk met een alcoholdoekje om eventuele bloedingen te stoppen. Plaats de muis in een warme omgeving bij 37 graden Celsius om het herstel te bevorderen.

Nanodeeltjes gevormd met de ABE- en GRNA-plasmiden hadden een uniforme sferische morfologie en een smalle grootteverdeling met een gemiddelde grootte van 202,9 nanometer. Een zeta-potentiaal van 2,77 millivolt en een polydispersiteitsindex van 0,22. In chitosan ingebed ABE-plasmide verbeterde het fluorescerende signaal in beenmergcellen aanzienlijk, wat wijst op een hogere transfectie-efficiëntie in vergelijking met de controlegroep.

Flowcytometrie bevestigde dat chitosan-gecodeerd ABE-plasmide een hoge transfectie-efficiëntie bereikte in beenmergcellen. Met een piekefficiëntie van 51,2% waargenomen bij een dosis van vier microgram, terwijl drie microgram een balans van hoge efficiëntie van 47,2% opleverde, onthulde Sanger-sequencing en PCR van genomisch DNA van beenmergcellen in vivo genbewerking op doellocatie A1 met 14,27% efficiëntie en op locatie A2 met 10,69% efficiëntie.